161816. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkalikus proteáz enzim bioszintetikus előállítására bacillus subtilis sűllyesztett tenyésztése útján
161816 6 kukoricaliszt szójaliszt CaCl2 KH2 P0 4 savkazein napraforgóolaj 2,0 % 1,0 % 0,1 %, 0,25%' 0,3 % 0,1 % A tenyészeteket 1 :1 levegőztetés mellett, 35 °C-on, 7,0 induló pH-n 24 órán át növesztettük; Az inokulumokat 1,7 m3 -es vasfermentorban elkészített 0,9 m3 , fentivel megegyező összetételű táptalajba oltottuk. Az inokolumok csiraszáma átlagosan 2 x 109 /ml, enzimaktivitásuk átlagosan 8,7 mAE/ml volt. A fermentációk során a kísérleti körülmények megegyeztek az inokulum fermentációknál leírtakkal. 48 óra múlva, amikor a tenyészlevekben elértük a maximális enzimaktivitást, a teljes térfogatokat szűrtük. Az éles szűrtleveket +5 °C-ra hűtöttük, pH 7,0-ra állítás után a szűrtlé térfogatokra számított 60% ammóniumszuliáttal kisóztuk az enzimfehérjét, majd szű-10 Kitűnik továbbá a táblázat adataiból, hogy az eljárásunk szerinti mennyiségű laktóz alkalmazásával a fermentációk adott körülmények mellett szaporodó és termelő fázisra tagolódnak. A két fázis közötti határvonal — amint az biológiai rendszerekben megszokott — teljesen élesen nem húzható meg. Amennyiben a határvonalat 24 órás korra helyezzük, amint a táblázatból látható, a szaporodó fázisban megtörténik a szaporodás 75,5%-a, ugyanakkor az enzimtermelésnek mindössze 3%-a következik be. Az enzimtermelés 97%,-a tehát a termelő fázisra esik. Az a körülmény, hogy amikor a tenyészlében már kialakult a teljes sejtszám 75,5%-a, de az 15 exoproteáz aktivitásának mindössze 3%-a volt jelen, arra utal, hogy a Bacillus subtilis exoproteáz szintézise a primer anyagcserétől elkülönülten, a szekunder metabolizmus szakaszában történik. 0 A táblázatból megállapítható továbbá, hogy a megfelelő mennyiségű laktóz alkalmazása félfolyamatos rendszerben további előnyökkel jár. Két fermentort igénylő félfolyamatos eljárásunk 25 lényege: az 1. fermentorban elkészített ,0,8% laktózt tartalmazó steril táptalajt beoltjuk. Amikor a tenyészet elszaporodott, és a laktóz koncentrációja kb. 0,4%, értéket ért el, a tenyészlé 10%-át a 2. fermentorban elkészített, az 30 előzővel megegyező összetételű táptalaj oltására alkalmazzuk. 1. példa: Az alkalikus proteáz termelésére alkalmazott Bacillus subtilis varietas proteolyticus spóraszuszpenzióját 170 literes vas inokulum készülékekben levő 100 liter, alábbi összetételű táptalajba oltottuk: 35 40 45 50 55 60 65 réssel elkülönítettük és 40 °C-os levegő átfúvatásával szárítottuk azt. 2 fermentorral, 2 inokulum készülékkel (2 x x 1,7 m3 + 2 x 0,17 m 3 = 3,74 m 3 fennentor térfogat) 14 nap alatt 11 sarzsot lehetett készíteni. A fermentlevek átlag aktivitása 30,7 mAE/ml, az átlagos fermentié összaktivitás 30,700 AE/sarzs volt. 48 órás korban a fermentlevek átlagos csíraszáma 3,2 x 109 /ml volt. Az átlagos szűrtlé térfogat 0,9 m3 , az átlagos szűrtlé aktivitás pedig 33,5 mAE/ml volt. Ez összesen 30.150 AE/sarzs-nak felelt meg. Az előállított termék súlya sarzsonként 12,88 kg, aktivitása 2,20 AE/g volt. A szűrtlé összaktivitására számított kitermelés 94,0% volt. 14 nap alatt a fentiek szerint előállított késztermék összaktivitása 311,696 AE volt. 2. példa: Az alkalikus proteáz termelésére alkalmazott Bacillus subtilis varietas proteolyticus spóraszuszpenzióját 170 literes vas inokulum készülékekben levő 100 liter alábbi összetételű táptalajba oltottuk: kukoricaliszt szójaliszt CaCl2 KH2 P0 4 laktóz savkazein napraforgóolaj 2,0 % 1,0 % 0,1 % 0y25% 0,8 %. (katabolit represszor) 0,3 % 0,1% A tenyészeteket 1 :1 levegőztetés mellett, 35 °C-on, 7,0 induló pH-n 24 órán 'át növesztettük. Ekkor csíraszámuk átlagosan 5 x 109 /ml, enzimaktivitásuk átlagosan 1,8 mAE/ml volt, laktóztartalmuk átlagosan 0,4% volt. A fermentációk során a kísérleti körülmények megegyeztek az inokulum fermentációknál leírtakkal. 48 óra múlva, amikor a tenyészlevekben elértük a maximális enzimaktivitást, a teljes térfogatokat szűrtük. Az éles szűrtleveket -f-5 °C-ra hűtöttük, pH 7,0-ra állítás után a szűrtlé térfogatokra számított 60% ammóniumszulfáttal kisóztuk az enzimfehérjét, majd szűréssel elkülönítettük és 40 °C-os levegő átfúvatásával szárítottuk azt. 2 fermentorral, 2 inokulum készülékkel (2x x 1,7 m3 + 2 x 0,17 m 3 = 3,74 m 3 fermentor térfogat) 14 nap alatt 11 sarzsot lehetett készíteni. A fermentlevek átlagos aktivitása 43,5 mAE/ml, az átlagos fermentié összaktivitás 43.500 AE/ /sarzs volt. 48 órás korban a fermentlevek átlagos csíraszáma 8,4 x 109 /ml volt. Azt átlagos szűrtlé térfogat 0,9 m3 , az átlagos szűrtlé aktivitás pedig 49,75 mAE/ml volt. Ez összesen 44.775 AE/sarzsnak felelt meg. Az előállított termék súlya sarzsonként 18,2 kg, aktivitása 2,34 AE/g volt. A szűrtlé összaktivitására számított kitermelés 95% volt. 3
