161816. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkalikus proteáz enzim bioszintetikus előállítására bacillus subtilis sűllyesztett tenyésztése útján

161816 Ismeretes, hogy a szakaszos fermentálás körülményei között Bacillusok és Streptomycesek proteáz produkciója nő, ha szénhidrátokat tartalmazó adalékokkal egészítik ki azok táptalaját. (Japan Patent 10951 (1965) June 1.; Japan 5 Patent 26055 (1964) Nov. 17. Minthogy a szerzők a szakaszos fermentálás keretei között maradtak, lényegében csak egy korábban leírt megfigyelést adaptáltak az általuk választott organizmus szakaszos növesztésére, nem említ- 10 ve, hogy az alkalmazott szénhidrátok a növekedés melyik szakaszában fejtik ki a produktivitásra pozitív hatásukat. Az idézett szabadalmi leírásokban említett 15 adalékok koncentráció-függő hatására utalt, hogy maximálják kiegészítésre használható mennyiségüket. A szénhidrátok represszív tulajdonságát dön- 20 tőén befolyásolja, hogy a metabolizmusba való belépésük milyen sebességgel történik. Példaként említjük Monod kísérleteit (Ann. Int. Pasteur, 1945, 71, 37.), amelyekkel bizonyította, hogy a glükóz gátolja a laktózbontás enzim- 25 rendszerének kialakulását, igazolva ezáltal, hogy a laktóz felvétele a glukózénál összetettebb folyamat. További bizonyítékok szolgálnak azonban arra, hogy a katabolit represszió ennél sokkal általánosabb jelenség, s minden olyan eset- 30 ben létrejön, amikor az adott szénhidrát katabolizmusa meghaladja a sejt bioszintetikus igényét (Moses et al.: Biochem. J., 1966, 100, 336). A laktóz — az említett idézettel egyezésben — előidézi Bacillus subtilis exoproteaz szintézisének átmeneti represszióját (táblázat). Azon megfigyelésünk, hogy a laktóz egy határkoncentrációig növeli az osztódás ütemét, de represszálja a spór ázást és a vele közvetlen biokémiai kapcsolatban levő exoproteaz szintézist, -lehetővé teszi olyan félfolyamatos fermentálási eljárás kidolgozását, melyben a laktóz koncentráció változásának következményeként minden egyes fermentáció szaporodó és termelő fázisra tagolódik. Eljárásunkat úgy valósítjuk meg, hogy a tenyészidő kezdetén a laktózt olyan koncentrációban visszük be, mely biztosítani tudja az optimumhoz közeleső szaporodási ütemet, de ugyanakkor nem nagyobb annál a mennyiségnél, amit a tenyészet a növekedés e körülményei között legaritmikus fázisának végéig igényel. Így a spórázás kezdetével egybeeső exoproteaz szintézis szakaszában (Shaeffer: Bacteriological Reviews,, Mar., 1969, p. 48—71) koncentrációja a repressziós szint alá csökken. A szekunder metabolizmus eredményeként jelentkező exoproteaz szintézis tehát elérheti a represzorforrást nem tartalmazó táptalajon mért?sebességét, s minthogy a sejtszám az osztódás sjzakaszában jelentősen emelkedett, számottevően nő a bruttó exoproteaz aktivitás is. Ezeket a törvényszerűségeket igazolja alábbi táblázatunk, melyet 1., 2. és 3. példánk adataiból állítottuk össze. Táblázat Bacillus subtilis varietas proteolyticus 00054 tenyészetek csíraszámának és aktivitásának alakulása a süllyesztett tenyésztés szaporodó és termelő fázisában, laktózmentes táptalajon és 0,8% laktóz jelenlétében. csiraszama A t e n y é s aktivitása mAE/ml 24 órás korban a szaporodó fázis végén átoltáskor csíraszáma t aktivitása mAE/ml a termelő fázis végén, amikor a tenyészet csúcsaktivitást ér el Laktóz nélküli táptalajon 8,7 2xl09 0,8% laktózt tartalmazó táptalajon 1,8 5 x 109 0,8% laktózt tartalmazó táptalajon félfolyamatos rendszerben 1,8 7,4 x 109 33,5 43,5 60,0 3,2 x 109 8,4 x 109 9,8 x 109 A táblázat adataiból és a példákból kitűnik, hogy azonos alaptáptalaj és azonos feltételek mellett a proteáz bioszintézise legkorábban a szénforrás nélküli táptalajon indul el. 60 Ha ugyanehhez a táptalajhoz 0,8% laktózt adunk, a kezdeti proteáz szintézis gyakorlatilag elmarad, ugyanakkor a csiraszám jelentős emelkedése tapasztalható. 65 Kísérleti eredményeink jszerint, adott rendszerben megállapítható a proteáz bioszintézis szempontjából optimális laktóz mennyiség, mely jelen esetben 0,8%. Kevesebb laktózzal nem érünk el megfelelő csiraszám emelkedést, több laktózzal pedig a termelés szaporodó fázisa elnyúlik és a tenyészet csak jóval később lép termelő fázisba (amikor laktóz koncentrációja kb. 0,4%-ig lecsökken). 2