161709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin kinyerésére fermentlevekből
13 tályos termék 96,3% Bi2-vitamint és 3,7% nem azonosított kobalamint tartalmaz, és nem tartalmaz faktor III-at. A kapott sötétvörös színű, légszáraz, kristályos termék termelési hányada 29,8%, a kiindulási fermentlé kobalamintartalmára, illetve 57,3% a Bi2-vitamintartalmára számolva. A termék nedvességtartalma 12%. Tehát savas és lúgos alumíniumoxiddal való tisztítással a hidrolizátumból eltávolíthatók a színes szennyező anyagok, továbbá az alumímíniumoxidon vizes acetonoldattal (d = 0,840) való kramatografálás útján a Bjj-vitamin elválasztható a faktor Ill-tól és más kobalaminoktól. Ezzel az eljárással az aceton-butanol-moslékon tenyésztett, termofil, metánképző baktériumok fermentlevéből kedvező termeléssel, kitűnő minőségű kristályos Bi2-vitamint kapunk. 2. példa A Propionibacterium shermanii (propionsavbaktériumok) fermentlevéből elkülönített biomasszát használjuk. Visszafolyató hűtővel, keverővel és hőmérővel felszerelt lombikba beadagolunk 20 g biomaszszát, 200 ml vizet, 1,1 g ammóniumrodanidot, 1,1 g Chloramin B-t, az elegyet sósavval pH 4,0-re megsavanyítjuk, majd az 1. példa szerint hidrolizáljuk. A hidrolizátumból a szilárd részecskéket centrifugálással eltávolítjuk, a csapadék feletti 228 ml térfogatú sárgásrózsaszínű folyadékot savas és lúgos alumíniumoxiddal tisztítjuk. A tisztítást úgy végezzük, hogy a pH 3,5-re beállított 228 ml térfogatú oldatot, mely a kémiai elemzési adatok szerint különböző kobalaminokból együttesen 5,180 mg-ot tartalmaz, feltöltjük H-fázisú alumí niumoxid-kromatografálóoszlopra (az alumíniumoxid vizes kivonatának pH-értéke — 3,0 a szorbensoszlop magassága = 3,5 cm, átmérője = 2 cm), 225 ml térfogatú rózsaszínű oldatot kapunk, melynek pH-értéke = 4,0. A szorbenst 120 ml 4,0 pH-jú vízzel mossuk, míg az eluátum színtelen lesz. A kapott 225 ml térfogatú oldatot a 2 n nátriumhidroxidoldattal pH-8,0-ra meglúgosítjuk, majd feltöltjük OH-fázisú alumíniumoxid-kromatografálóoszlopra (az alumíniumoxid vizes kivonatának pH-értéke = 10; a szorbensoszlop magassága = 3 cm, keresztmetszete = 2 cm); ezután az előző lépcsőben kapott mosóvizet, és még 10 ml vizet meglúgqsítunk pH-8,0-ra, és ezeket is feltöltjük a kromatografálóoszlopra. A kapott tisztított oldat pH-értéke = 9, össztérfogata = 350 ml, az oldat rózsaszínű. A kapott oldatban 105 mg káliumcianidot oldunk, majd 1 térfogatrész fenol és 1,1 térfogatrészt széntetraklorid elegyével a kobalaminokat kvantitatíve kivonjuk az oldatból. Az elkülönített 84 ml szerves oldószeres fázishoz 126 ml széntetrakloridot és 67 ml butanolt töltünk, majd kevés vízzel többször kirázzuk az oldatot a kobalaminok extrahálása céljából. Az egyesített vizes kivonatot, (melynek térfogata 100 ml) éterrel mossuk. Fotoelektrokoloriméteres mérések 14 eredménye szerint a kapott oldat különböző kobalamlnokból együttesen 5,500 mg-ot tartalmaz, ez a hidrolizátum kobalamintartalmára számolva 106%. 5 Az oldatot vákuumban kis térfogatra bepárologtatjuk, négy térfogatrész acetonnal hígítjuk, majd alumíniumoxidoszlopon kromatografáljuk, az oldószerelegy 77 súlyszázalék acetont tartalmazó aceton-víz elegy. Az eluálást 47 súly% 10 acetont tartalmazó aceton-víz eleggyel végezzük. A vizes-acetonos eluátumot néhány térfogatrész acetonnal hígítjuk, és a Bi2-vitarnint kikristályosítjuk. A kémiai elemzési adatok szerint a kapott 15 légszáraz kristályos termék mennyisége 3,7 mg, a kiindulási hidrolizátum kobalamintartalmára számolt termelési hányad 71,4%, A papírelektroforézises vizsgálat eredménye szerint a kristályos termék 97,8% B12 -vitamint, és 2,2% más 20 kobalaminokat tartalmaz, színes szennyező anyagoktól mentes. A propionsav-baktériumos biomassza hidrolizátum tehát az alumíniumoxid fenti két formájával eredményesen tisztítható, és a tisztítás 25 után jó termeléssel különíthető el a kristályos Bia-vitamin. 3. példa 30 A Propionibacterium Shermanii propionsavbaktériumok 80% nedvességet tartalmazó biomasszájából 20 g-ot visszafolyató hűtővel és keverővel felszerelt lombikba töltünk, beadago-35 lünk 50 ml vizet és 150 ml acetont, majd 1,1 g ammóniumrodanid jelenlétében szobahőmérsékleten 2 órán át extrahálunk. A szilárd részecskéket centrifugálással eltávolítjuk. A centrifugálással elkülönített folyadékból az acetont le-40 desztilláljuk, á visszamaradt vizes folyadékot vízzel 100 ml-re kiegészítjük. Ezt a sárgásrózsa-* színű vizes oldatot, mely a kémiai elemzési adatok szerint különböző kobalaminokból együttesen 4,66 mg-ot tartalmaz, az alumíniumoxid két 45 formájával való tisztításnak vethetjük alá. Az oldatot 2 n sósavval pH 3,5-re megsavanyítjuk, azután feltöltjük savas alumíniumoxidkromatografálóöszlopra ós a 2. példában leírt módon járunk el. 105 ml rózsaszínű oldatot 50 (pH = 4,0) és 70 ml mosóvizet (pH = 4,0) kapunk. Ezeket a folyadékokat 2 n nátriumhidroxidoldattal pH 8,0-ra meglúgosítjuk, majd a 2. példa szerint járunk el, először az oldatot és utána a mosóvizet és végül 15 ml 8,0 pH-jú vizet 55 átengedünk egy lúgos alumíniumhidroxid-kromatografálóoszlopon. A kapott 190 ml tisztított oldat rózsaszínű, pH-értéke = 9. Fenti tisztított oldattal a 2. példa szerint járunk el, majd fotoelektrokolorimetriás módszer-60 rel meghatározzuk az oldat kobalamintartalmát. Az oldat 3,710 mg kobalamint tartalmaz;, a termelés 79,6% — a kiindulási vizes-acetonos kivonat kobalamintartalmára számolva. Az oldatot a 2. példa szerint vákuumban be-65 sűrítjük, acetonnal felhígítjuk, alumíniumoxid-7
