161709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin kinyerésére fermentlevekből
11 161709 12 A találmány a Bi2-vitaminnak az azt termelő különböző mikroorganizmusokat tartalmazó fermentlevekből való kinyerésére vonatkozik. Különösen előnyös az eljárás az erősen színes szubsztrátumok, pl. a metánképző baktériumokat tartalmazó fermentlevek vagy biomasszák feldolgozása esetén. A Bi2-vitamin elkülönítésére vonatkozó találmányunk szerinti eljárás lehetővé teszi valamely olcsó fermentlé, pl. a termofil metánképző baktériumok hulladékon, pl. aceton-butanolmoslékon képződő tenyészete alkalmazásával kitűnő minőségű, kristályos Bi2-vitamin kedvező termelési hányaddal való előállítását. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példák segítségével közelebbről ismertetjük. 1. példa Aceton-butanol-moslékon tenyésztett, metánképző baktériumokat tartalmazó fermentlevet használunk, melyben Bi2-vitaminon kívül faktor III és más kobalaminok is jelentős mennyiségben vannak jelen. 600 liter fenti fermentlevet töltünk a hidrolizáló készülékbe, 3 kg ammóniumrodanidot, 3 kg klóramin-B-t adunk hozzá, és annyi sósavat, amennyi a pH = 4,0 érték beállításához szükséges, egy órán át 96—98 C°-on hidrolizáljuk a reakcióelegyet, majd egy órán át melegítés nélkül folytatjük a reakciót. Ezután sósavval beállítjuk a 2,5 és 2,7 közötti pH-értéket, majd néhány óra múlva a folyadékot a csapadékról dekantáljük. A dekantált folyadék kobalamintartalma a fermentleben eredetileg jelén volt menynyiségre számolva 98,3%. A dekantált folyadékot, melynek pH-értéke 2,5—2,7, monofunkciós, karboxil-kationcserélő, H-f ázisú polimergyantával töltött oszlopokon vezetjük át, az ioncserélőgyanta a kobalaminokat adszorbeálja. Az adszorpció befejezte után a kátioncserélőt 2,5—2,7 pH-jú mosóvízzel mossuk. A kobalaminok a kationcserélőről való deszorbeálása céljából a kationcserélőt In vizes ammóniaoldatos kezeléssel NHí-fázisúvá alakítjuk át, majd ammonias borát-pufferoldattal (5,2 g bórsav és 0,1 g ammóniumrodanid 1 liter 0,27—0,33 n vizes ammóniaoldatban oldva) eluáljuk a kobalaminokat. A sötétbarna színű, lúgos oldathoz, melynek pH-értéke kb. 11, annyi sósavat adunk, amenynyi a pH 8,0 beállításához szükséges, majd statikus körülmények között lúgos alumíniűmoxiddal kezeljük az oldatot (a szorbens vizes, kivonatának pH-értéke = 10), a szorbensből 0,1 részt adunk a feldolgozandó folyadékvolumenhez, és a szorbenst többször cseréljük újabb adagok hozzáadásával, míg piros színű, 9 pH-értékű oldatot kapunk. A lúgos szorbenst dekantálással elkülönítjük és 8,0 pH-jú vízzel mossuk. A dekantált lúgos folyadékot és a mosóvizet annyi sósavval savanyítjuk meg, amennyi a 2,5— 3,0 pH-érték beállításához szükséges, majd savas alumíniumoxiddal kezeljük az oldatot (a szorbens vizes kivonatának ph-ja = 2,5—3,0). A műveletet statikus körülmények között a fenti módon végezzük, a szorbenst cseréljük újabb adag hozzáadásával, míg 4,0 pH-értékű, rózsa-5 színű oldatot kapunk. A savas szorbenst dekantálással elkülönítjük, majd 4,0 pH-értékű mosóvízzel gondosan mossuk. A dekantált savas folyadékot és a mosóvizet 10 egyesítjük, és annyi 2n nátriumhidroxid-oldatot adunk hozzá, amennyi a 8,0 pH-érték beállításához szükséges; az ekkor képződő kevés csapadékot szűréssel eltávolítjuk. A kapott tisztított Szűrlet kobalamintartalma a kiindulási mennyi-15 ségre számolva 68,5%. A fenti szűrletet káliumcianiddal (0,03 súlyszázalék) kezeljük. A ciáhozott, világos málnavörös színű oldatból a kobalaminokat 1 térfogatrész fenol és 1,1 térfogatrész széntetraklorid 20 elegyével extraháljuk. Az elkülönült szerves oldószeres fázishoz 1,5 térfogatrész széntetrakloridot és 0,8 térfogatrész butanolt adunk. Ebből a szerves oldószerelegyből a kobalaminokat kevés vízzel ismételten extraháljuk. A kapott málna-25 vörös színű vizes kivonatot éterrel mossuk. A kapott kivonat kobalamintartalma a kiindulási mennyiségre számolva 69,3%. A vizes kivonatot vákuumban kis térfogatra bepárologtatjuk. A koncentrátumot négyszeres 30 térfogatmennyiségű acetonnal hígítjuk. Az oldatból idővel csapadék formájában kiváló szennyező anyagokat szűréssel eltávolítjuk. A vizes-acetonos szűrletet feltöltjük alumíniumoxiddal töltött kromatografálóoszlopba a 35 Bi2-vitaminnak a kísérő kobalaminoktól való elválasztása céljából. A kobalaminokat 77 súlyszázalék acetont tartalmazó aceton-víz elegyben választjuk el, és 47 súlyszázalék acetont tartalmazó aceton-víz eleggyel eluáljuk. Külön fogjuk 40 fel az eluátumnak a Bi2-vitamint és a B12 -vitamin faktor,III-at, valamint néhány más kobalamint tartalmazó frakcióját. A Bi2-vitamin a vizes-acetonos eluátumból néhány térfogatrész aceton hozzáadása után kikristályosodik, a kris-45 tályok sötétvörös színűek. A kapott sötétvörös színű, légszáraz, kristályos termék termelési hányada a kiindulási fermentlé kobalamintartalmára számolva 59,1%, a 50 kristályok nedvességtartalma 12%. Elektroforézises és papírkromatográfiás vizsgálatok eredményei szerint ez a kristályos termék 64% Bi2-vitamint, 29% Bi2-vitamin faktor III-at, és 7% nem azonosított kobalamint 55 tartalmaz, színes, szennyező idegen anyagoktól mentes a termék. Ezt a nyersterméket a Bia-vitamin a faktor III-tól való elválasztása céljából vizes acetonoldatban (d = 0,840) oldjuk, és ezzel az oldószer-60 eleggyel alumíniumoxidon kromatografáljuk, majd a Bi2 -vitamint vizes acetonoldattal (d = 0,897) eluáljuk. A vizes-acetonos eluátumból a fenti módon kristályosítjuk a Bi2-vitamint. Elektroforézises és papírkromatográfiás vizs-65 gálatok eredményei szerint a kapott tiszta, kris-6
