161709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin kinyerésére fermentlevekből
5 161709 6 a Bi2-vitamint acetonból, dioxánból, vagy metanolból kristályosítják. Ha más kobalaminokon kívül Bi2-vitamin faktor III (5-oxibenzimidazolkobalamin) is van az elegyben, ez utóbbit speciális kezeléssel, pl. cellulózporon való kroniatografálással kell a Bi2-vitamintór elkülöníteni. A találmány a Bi2-vitaminnak az aceton-butanol-moslékon tenyésztett termofil metánképző baktériumok fermentlevéből kristályos formában való kinyerésére vonatkozik, Bonyolult, szerves szubsztrátumokon hozunk létre metánképző baktériumos erjedést vegyes baktériumtenyészettel, melyben természetes életközösségben vannak anaerob baktériumok, többek között rothadást okozó és metánképző baktériumok. Az ilyen vegyes tenyészetnek nagy jelentősége van, mint a Bi2 -vitamin nagyipari méretekben való előállítására alkalmas mikroorganizmus-tenyészetnek, mert nem steril körülmények között végezhető vele a fermentáció, táptalajként olcsó nyersanyagok használhatók: az élelmiszeripar, a fafeldolgozó vegyipar és egyéb ipari üzemek melléktermékei, valamint szennyvizek hasznosíthatók ilyen módon. Ha az ilyen táptalajokhoz olyan anyagokat adunk, amelyek a Big-vitamin bioszintézisét stimulálják, a B-vitaminnak' a fermentleben való felszaporodása észrevehetően fokozódik. A metánképző baktériumok fermentlevében azonban sok a színes szennyezőanyag, és jelentős mennyiségű faktor Ill-t is tartalmaz, ezért a fermentlé tisztítása hosszadalmas és bonyolult művelet, melynek során nagy a Bi2-vitaminveszteség. Ez megdrágítja a készítmény előállítását. Annak érdekében, hogy olcsón állíthassuk elő a Bi2-vitamint a fent említett szubsztrátumból, a tisztítási folyamatot egyszerűvé és gazdaságossá kell tennünk. E követelménynek megfelel a színes szennyezőanyagok eltávolítására és a faktor III elkülönítésére vonatkozó tisztítási eljárásunk. A már említett, és még más célok is megvalósíthatók a találmányunk szerinti eljárással, amellyel fermentléből az alábbiakban leírt módon nyerhető ki a Bi2-vitamin. A Bj2-vitamint termelő mikroorganizmusokat tartalmazó fermentlevet hidrolizáljuk, vagy víz/ szerves oldószer-elegyekkel extraháljuk. Az említett fermentléből elkülönített biomasszát is alávetjük hidrolízisnek, vagy víz/szerves oldószerelegyekkel extraháljuk azt. A hidrolízist különböző közegben, pl. savas közegben végezhetjük, különféle stabilizátorok jelenlétében, vagy lúgos közegben, cianidok jelenlétében. Savas közegben, 4,0 pH-értékerí való hidrolizálást ajánlunk 0,5 súlyszázalék ammóniumrodanid vagy 0,01 súlyszázalók káliumcia^ nid stabilizátor és 0,5 súlyszázalék N-klórbenzolszulfamid-nátriumsó (a továbbiakban klóramin B) vagy 0,25 súlyszázalék klórszukcinimid roncsolóanyag jelenlétében, 96—98 C°-on. Ha ilyen körülmények között hidrolizálunk, a kötött B-vitamin gyakorlatilag teljes egészében szabaddá válik. A fermentlevet, vagy a belőle elkülönített biomasszát víz és valamilyen szerves oldószer ele-5 gyével, pl. víz/aceton, víz/metanol-, víz/etanol-, víz/izopropanol-eleggyel extraháljuk. Előnyösnek találtuk víz és szerves oldószer olyan elegyével történő extrahálást, amely 70—75 súlyszázalék acetont tartalmaz; az extrakciót 0,5 10 súlyszázalék ammóniumrodanid jelenlétébén folytatjuk le, majd az extrakció után az acetont ledesztilláljuk. A kapott hidrolizátumot vagy extraktumot 3— I5 5 pH-jú közegben savas alakban levő alumíniumoxiddal, majd 8—10 pH-értéknél, alkalikus oldatban levő alumíniumoxiddal, mint szorbenssel kezeljük. A színes szennyezőanyagokat az említett szorbensek adszorbeálják, a Bia-vita-20 min pedig a vizes oldatban marad. A savas alumíniumoxidnak 3 körüli pH-értékű vizes kivonatot, a lúgos alumíniumoxidnak 10 körüli pH-értékű vizes kivonatot kell adnia. Az alumíniumoxid savas és lúgos alakjá-25 val való kezelést tetszőleges sorrendben végezhetjük, más szóval alkalmazhatjuk először a savas és azután a lúgos alakot, vagy először a lúgos és azután a savas alakot. A színes szennyezőanyagokat akár statikus, akár dinamikus körül-30 menyek között adszorbeáltathatjuk oszlopokban szorbenssel. Előnyösnek találtuk ezeket a műveleteket dinamikus körülmények között végezni, mert így a szorbens adszorbeálóképessége maximálisan 35 kihasználható, és mert így könnyebben mosható a szorbens. A színes szennyezőanyagoktól megtisztított oldatot lúgos közegben cianidokkal ciánozzuk a Bi2-vitamin ciánod-alakba való átalakítása céljá-4° ból. Cianidként káliumcianidot, nátriumcianidot vagy más, CN-csoport leadására képes vegyületeket használhatunk. A ciano-alakba alakított Bi2-vitamint vízzel nem, vagy rosszul elegyedő, nem poláros oldó-45 szerekkel extraháljuk a szennyezőanyagoktól, pl. a sóktól, fehérjéktől stb. való elkülönítés céljából. Erre a célra a legalkalmasabb oldószerek a fenolok elegyei kloroformmal, széntetrakloriddal stb. A Bi2-vitamint tartalmazó szerves oldó-50 szeres réteget elkülönítjük, azután nem poláros oldószereket, valamint butil-, propil- vagy izopropil-alkoholokat elegyítünk hozzá, majd egyegy extrakcióhoz kevés vizet használva, vízzel extraháljuk a Bo-vitamint. Az extrakcióhoz elő-55 nyösen 1 térfogatrész fenol és 1,1 térfogatrész széntetraklorid elegyét használjuk, majd a B-vitaminnak a szerves fázisból a vízbe való kiszorítása céljából széntetrakloridot és butanolt adunk az elegyhez. 60 Fenti körülmények között a szennyezőanyargok úgy távolíthatók el, hogy a Bi2-vitaminbál csak jelentéktelen mennyiség megy veszendőbe. A Bi2-vitaminnak a kísérő kobalaminoktól való elkülönítése céljából a kapott, tisztított ol-65 tot alumíniumoxidon kromatograf áljuk vizes 3
