161694. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) cisz-1,2-epoxipropilfoszfonsav előállítására

5 161694 6 A táptalaj pH-jának értéke azon szempont figyelembevételével, hogy alkalmas legyen a mikroorganizmus növekedésének és az antibiotikum termelésének biztosítására, körülbelül 5,0—9,0 között váltakozhat. A kitüntetett pH-tartomány azonban körülbelül 6,0—7,5. A fermentációs folyamat végrehajtása során a sejtszuszpenziót úgy állítjuk elő, hogy steril táptalajt adagolunk a (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav-termelő mikroorganizmus ferde agar tenyészetéhez. Az agartenyészetet használjuk fel ezután egy inokulumlombik beoltására és az inokulumlombikot körülbelül 28 °C-on rázatjuk, jó növekedés elérésére 1—3 napon át. Az inokulumlombikot ezután a termelő lombikok beoltására használjuk fel. Egy másik megoldás szerint az inokulumlombikot liofilizált tenyészettel vagy fagyasztott inokulummal olthatjuk be. Az inokulálást általában úgy hajtjuk végre, hogy körülbelül 1 ml-t veszünk 30 ml termelő táptalaj beoltására, amely a kívánt koncentrációjú foszfort tartalmazza. A fermentációt 2—4 napon át folytatjuk a táptalaj kevertetése és/vagy levegőztetése mellett, a hőmérsékletet körülbelül 28 °C-on tartva. Ezután, általában 3—4 nap múlva megvizsgáljuk valamennyi termelő lombikot, azaz az adagolt foszfort tartalmazó és a kontrollként használt lombikokat az egyes lombikokban képződött antibiotikum mennyiségének meghatározására. A (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsavat egyszerűen határozhatjuk meg a gyűrűs-lemezes módszerrel, tesztorganizmusként Proteus vulgaris MB—838 (ATCC 21 100 és NRRL B-3361) alkalmazásával. A tesztorganizmust 0,2% Difco élesztőkivonatot tartalmazó Difco tápagaron ferde tenyészetben tartjuk fenn. A beoltott kémcsöveket 18—24 órán át 37 °C-on inkubáljuk és egy hétig hűtőszoba-hőmérsékleten tároljuk. Hetenként készítünk friss ferdeagar-tenyészeteket. A próbalemezek inokulumát naponta állítjuk elő úgy, hogy 50 ml Difco táplevest — amely 0,2% Difco élesztőkivonatot tartalmaz — 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban a ferde tenyészettel, lekaparással oltunk be. A lombikot 18—24 órán át 37 °C-on rázógépen inkubáljuk. A tenyészetet ezután 660 m/* hullámhosszon 40% áteresztésre állítjuk be Bausch & Lomb Spectronic 20 alkalmazásával oly módon, hogy 0,2%-os élesztőkivonat-oldatot adagolunk a tenyészethez. Ehhez a meghatározáshoz vakértékként beoltatlan táptalajt használunk. A beállított táptalajból 30 ml-t veszünk 1 1 táptalaj beoltásához. Vizsgálati táptalajként 0,2% Difco élesztőkivonatot tartalmazó Difco tápagart használtunk. Elkészítettük ezt a táptalajt, autoklávozással sterileztük, és 50 °C-ra hagytuk hűlni. A táptalaj beoltása után 10—10 ml-t adagoltunk 1—1 Petricsészébe és a táptalajt engedtük megszilárdulni. Az aktivitást egységekben fejeztük ki: 1 egység az antibiotikum azon koncentrációja/ml, amely egy 12,7 mm átmérőjű papírkorongon 28 mm zónaátmérőt hoz létre. A standard görbe felvételére 4 koncentrációt alkalmaztunk: 0,3; 0,4; 0,6 és 0,8 egység/ml értékeket. Az egyes koncentrációkat pH 8,0-ra beállított 0,05 M trisz-hidroximetil-aminometán pufferrel való hígí-5 tással állítottuk elő. A standard görbe felvételére az öt lemez mindegyikére 4 korongot helyeztünk; minden lemez a fenti négy antibiotikum-koncentráció mindegyikét tartalmazta egy korongon. A lemezeket 18 órán 37 °C-on inkubáltuk és mil-10 liméterben lemértük a gátlási zónák átmérőjét. Mindegyik koncentrációra kiszámítottuk az átlagos zónaátméröt; ebből féllogaritmikus papíron felvettük a standard görbét. A kapott egyenes hajlásszöge 4—5. 15 A termelő lombikokat ezután meghatározzuk oly módon, hogy a mintát pH 8 0,05 mólos pufferben megfelelő koncentrációra hígítjuk. A tesztorganizmus Proteus vulgaris MB—838, a vizsgálati táptalaj 0,2% élesztőkivonatot tartal-0 mázó tápagar. Akár a korong-lemezes, akár a henger-lemezes vizsgálati módszert alkalmazzuk, 10—15 ml táptalajt veszünk lemezenként. Ha a korong-lemezes eljárást alkalmazzuk, a korongokat 0,4 egység/ml koncentrációjú antibiotikum-25 oldatba merítjük, és a mintával szemben helyezzük el a lemezen. A lemezeket ezután 18 órán át inkubáljuk 37 °C-on és meghatározzuk milliméterben a zónaátmérőket. Ha a henger-lemezes eljárást alkalmazzuk, lemezenként 6 hengert ve*" szünk, hármat a minta és hármat a kontrolloldat számára és váltogatva helyezzük el a mintát és a kontrolloldatot. A kontrolloldat 1 gamma/ml szabad savat tartalmaz. Öt standard lemezt alkalmaztunk, amelyek hat standard koncentrációt tartalmaznak 0,25 gamma/ml — 3,0 gamma/ml között. A vizsgálatot Nomograph segítségével értékeljük és az eredményeket egység — vagy gamma/ml-ben adjuk meg. A szabad sav egy egységnyi mennyisége 2,8 gamma. Az antibiotikum számos eljárással tisztítható és nyerhető ki tisztább alakban. Egy ilyen eljárás szerint az antibiotikumot alumíniumoxidon adszorbeáltatjuk; ehhez a tisztításhoz megfelelő . akár a bázissal, akár a savval mosott alumíniumoxid. Az adszorbeált antibiotikum legegyszerűbben körülbelül pH 11,2 vizes vagy vizes-alkoholos ammóniumhidroxid-oldatokkal eluálható, az eluátum frakcionált felfogása mellett. A (-) cisz-50 -1,2-epoxipropilfoszfonsav ammóniumsóját tartalmazó szennyezett szilárd frakciók tisztítása ugyancsak végrehajtható úgy, hogy az anyagot metanolban oldjuk, hozzáadunk azonos mennyiségű n-butanolt, ledesztilláljuk a metanolt, kiszűrjük a butanolban oldhatatlan anyagokat; így egy butanolos oldatot kapunk, amely a tisztított antibiotikum ammóniumsóját tartalmazza. Az ammóniumsó ezután szilárd alakban nyerhető ki oly módon, hogy a butanolos oldatot csökkentett 60 nyomáson szárazra pároljuk. Egy másik megoldás szerint az ammóniumsó vízzel extrahálható a butanolos oldatból: így a (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav ammóniumsójának vizes oldatát kap-65 juk. Az antibiotikum kalciumsóját úgy állítjuk