161694. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) cisz-1,2-epoxipropilfoszfonsav előállítására

í 161694 3 4 ces-törzseket tenyésztünk, amelyeket ugyancsak talajból izoláltunk és a Merck & Co., Inc. tenyészetgyűjteményében MA—2867, MA—2903, MA—2916, MA—2917, MA—3270, MA—3272 és MA—3287 jelöléssel azonosítottunk. Ezeket a tenyészeteket a Streptomyces viridochromogenes species tagjaiként osztályoztuk. Az MA—2903, MA—2867, MA—2916, MA—2917 és MA—3270 jelű tenyészeteket az US Department of Agriculture Northern Utilization Research & Development Division törzsgyűjteményében helyeztük el állandó megőrzésre a következő jelölések alatt: NRRL—3413, NRRL—3414, NRRL—3415, NRRL—3416, illetve NRRL—3427. Az MA—3269 jelű tenyészetet a Streptomyces wedmorensis speciessel azonosítottuk és az NRRL—3426 számmal láttuk el. A fenti mikroorganizmus-féleségeken kívül megvizsgáltuk más mikroorganizmusok — többek között Streptomyces-törzsek — alkalmazásának lehetőségét, amelyeket vagy a természetből izoláltunk, vagy ezen organizmusok mutációjával állítottunk elő. Ezeket a mutánsokat természetes szelekcióval kaptuk, vagy mutagen ágensek, például X-besugárzás, UV-besugárzás, nitrogénmustárok stb. segítségével állítottuk elő. Mivel lényeges nehézségekkel jár a tiszta (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav elválasztása a fermentleben jelenlevő nagy mennyiségű szenynyezéstől, igen fontos, hogy módot találjunk a i'ermentlében jelenlevő össz-szárazanyaghoz viszonyított antibiotikum-koncentráció növelésére. Azt találtuk, hogy foszfor hozzáadása komplex szerves és kémiailag definiált fermentációs táptalajokhoz fokozza a (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav termelését. „Komplex szerves táptalajon" olyan táptalajt értünk, amelyben néhány komponens kémiailag nem definiált. Példa az ilyen táptalajra az, amely őrölt zabból kapott termékeket, szójalisztet, nátriumcitrátot, poliglikolt és desztillációs maradékokat tartalmaz. A „kémiailag definiált táptalaj" névvel olyan táptalajokat jelölünk, amelyekben valamennyi komponens kémiailag definiált. Példa az ilyen közegre az, amely kukoricakeményítőt, káliumhidrogénfoszfátot, nátriumcitrátot, aszparagint, metionint, mononátriumglutamátot, kalciumkloridot, magnéziumszulfátot és vas(III)-szulfátot tartalmaz. Az antibiotikum-termelés fokozásához szükséges foszfor mennyisége az alkalmazott közegtől függően változik. Antibiotikum-termelést figyeltünk meg olyan közegekben, amelyek foszforforrásként max. 10,0 g/l CaHP04-ot tartalmaznak. Jó antibiotikum-termelés elérésére azonban ajánlatos körülbelül 0,1 g/l — kb. 1,0 g/l foszfor alkalmazása. Foszfor hozzáadása a komplex szerves tápanyagokat tartalmazó közeghez 30—60%-kal növeli a (-) cisz^l,2-epoxipropilfoszfonsav termelését, ha az esetleg jelenlevő foszfor mennyiségét 0,2—0,4 g/l foszfor hozzáadásával növeljük. Ennek megfelelően kémiailag definiált vagy szintetikus táptalajban kimutatható volt, hogy foszforforrás hozzáadása kb. 3 ,"g/ml — kb. 41 ,«g/ml értékkel növeli a (-) cisz-l,2-epoxipropilf oszf ons av-termelés t. A foszfor adagolható fém alakban, de előnyösebbnek tartjuk azt a változatot, amikor foszforvegyület alakjában előnyösen szervetlen sóként adagoljuk, például káliumhidrogénfoszfát, nátriumhidrogénfoszfát vagy kalciumhidrogénfoszfát formájában. Foszforforrásként alkalmazhatók szerves vegyületek, például foszfoglicerinsav, 2-aminoetilfoszfonsav, glukóz-1-foszfát, glukóz-6-foszfát és dinátriuminozinát. A foszfor bevihető valamely természetben előforduló foszforsóként vagy komplexként, amely például jelen lehet a foszforban gazdag mikrobiális tápanyagokban. A szokásos komponensek a következők: asszimilálható szénforrás, asszimilálható nitrogénforrás, szervetlen sók és szükség esetén növekedési faktorok. Javasoljuk a foszfor hozzáadását a (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav termelésére képes más mikroorganizmusokat tartalmazó fermentlevekhez is. Annak igazolására, hogy a megnövekedett hatóérték foszfor jelenlétének tulajdonítható, a fermentációt végrehajtottuk más sók, például kálium- és nátriumklorid, jelenlétében is. Minden esetben csak a foszforforrás hozzáadása után lépett fel hatóérték-növekedés. Bár a találmány szerinti új antibiotikum felületi és süllyesztett tenyészetben egyaránt előállítható, újabban előnyben részesítjük a fermentáció süllyesztett fázisban való végrehajtását. A kis volumenű fermentációkat előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy megfelelő mennyiségű táptalajt mérünk be lombikokba, a lombikokat és ezek tartalmát 120 c

C-ra való melegítéssel sterilezzük, a lombikokat beoltjuk valamely (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav-termelő mikroorganizmus, például valamely Streptomyces-törzs spóráival vagy vegetatív sejttenyészetével, lazán bedugjuk a lombikok nyakát vattával, és 3—5 napon át állandó hőmérsékletű helyiségben körülbelül 28 °C-on rázógépen folytatjuk le a fermentációt. Nagyobb volumenű termelés esetén célszerű a fermentáció megfelelő, keverővel és a fermentlé levegőztetésére szolgáló berendezésekkel ellátott tankokban való levezetése. E módszer alkalmazása esetén a táptalajt a tankban állítjuk össze és 120 °C-on való tartással sterilizáljuk. Lehűlés után a sterilizált táptalajt a mikroorganizmus vegetatív sejttenyészetét szolgáltató megfelelő forrással oltjuk be, és 2—4 napon át folytatjuk a fermentációt a táptalaj kevertetése és/vagy levegőztetése közben, a hőmérséklet körülbelül 28 cC-on való tartása mellett. Ez a (-) cisz-l,2-epoxipropilf oszfonsav-termelési módszer különösen alkalmas nagy mennyiségű új antibiotikum előállítására. A (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsavat termelő mikroorganizmus alkalmazásával lefolytatott fermentációt körülbelül 20—40 °C hőmérsékleten hajthatjuk végre. Optimális eredmények elérésére azonban célszerűbb a fermentáció 26— 30 °C közötti hőmérsékleteken való lefolytatása. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60