161654. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyarozs alkaloidok előállítására fermentációval
161654 8% malátakivonat agáron tenyésztve 25 °C-on 14 napos inkubálás után: Telepátmérő 22 mm, a telep színe fehér, a telep hátoldala halványdrapp. A telep szerkezete: kicsit domború, nemezes, egyenes szegélyű. Mikroszkópi kép: 3—6 'n vastag elágazó hifák, sok tömör sejtcsomóval, amelyekben a hifaszerkezet nem ismerhető fel. 21 napos inkubálás után: Telepátmérő 30 mm, a telep színe: halványdrapp felület, világosbarna fonák. Hullámos. Mikroszkópi kép: konidium nincs, az egész tenyészetben különálló hifák nem figyelhetők meg, e helyett tömörebben és lazábban egymás mellett 4—6x8—10 /* nagyságú, vagy 6—8 ^ átmérőjű zsírszemcsékkel telt sejtek vannak. Burgonya-dextróz agáron tenyésztve 25 °C-on 14 napos inkubálás után: Telepátmérő: 25 mm, a telep felülete fehér, nemezes, domború, hullámosodó, a fonák halványdrapp. A telep belsejében 3—6 p vastag hifák vannak, amelyek többszörösen elágazódnak. Harántfalak 4—15 f* távolságban figyelhetők meg. A sejtekben nagy mennyiségben találhatók zsírszemcsék. Konidiumképződés nem figyelhető meg. 21 napos inkubálás után: Telepátmérő: 32 mm, felület halványlilás drapp színű, a fonák sötétebb barnás árnyalatú. A telep felülete, erősen hullámos. Mikroszkópi kép: 8—15x6—12 i* méretű, illetve 8—10 P átmérőjű sejtek, a sejtekben sok közepes és nagy zsírszemcse található. A felületi tenyészetből oltott, alámerülő, rázatással levegőztetett tenyészetben megfigyelhető a jellegzetes alkaloidtermelő tenyészet fokozatos kialakulása: 8—12 órai inkubálás után az inokulum sejtjeiből kötegekben 3—6 /* vastag hifák hajtanak, amelyeken elágazás nincs, a sejtekben kis-közepes zsírszemcsék vannak. Válaszfalak csak ritkán fordulnak elő. 24 órai inkubálás után a kötegekben levő hifákon oldalágak jelennek meg, amelyek ismételten elágazódnak, a zsírszemcsék nagyobbak. 48 órai inkubálás után az elágazódás és a zsírszemcsék növekedése fokozódik, a hifákon válaszfalak jelennek meg 6—15 n távolságban. 96 órai inkubálás után a hifacsomók feldarabolódása megindul, a levált kis hifacsomók az előbbiekhez hasonló módon növekednek tovább. Az új sektekben egyre nagyobbak a zsírszemcsék. Ha az ilyen tenyészetet 10—20%-os oltóanyaggal friss táptalajra oltjuk, az új hifák elágazódása már 8—12 órai inkubálás után megindul, és 7 napos korban ez az újabb tenyészet már túlnyomórészt olyan sejtekből áll, mint a 21 napos felületi tenyészet. A törzs fenntartása vagy liofilizált állapotban, vagy felületi és rázott tenyészetben való váltakozó átoltásokkal történik. A törzs termelőképességének fenntartására legalkalmasabb a 40% szacharózt tartalmazó, egyébként az első példában leírt táptalaj. A fe-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 lületi tenyészeteket elegendő 6—8 hetes korban átoltani, a rázott tenyészetek optimális átoltási ideje a fenti táptalajon 2 hét. Az új törzs szaprofitatenyészetben történő alkaloidtermelés céljából történő tenyésztésére célszerűen szénhidrátot, szerves savat, ammóniát és ásványi sókat tartalmazó táptalajt használunk. A találmány tárgyát tehát olyan eljárás képezi, anyarozs alkaloidok, főként ergotamin mikrobiológiai úton, szaprofitatenyészetben való előállítására, amelynek során az OKI-nál 56/70. sz. alatt letétbe helyezett új anyarozs (Claviceps purpurea) törzset felületi vagy alámerülő tenyészetben szénforrást, nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó táptalajon tenyésztjük és a micéliumból és fermentléből az alkaloidokat önmagában ismert módon kinyerjük. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját közelebbről az alábbi példák szemléltetik: 1. példa Egy 250 ml össztérfogatú Erlenmeyer-lombikba 50 ml alábbi összetételű táptalajt viszünk be: Szacharóz 10% borostyánkősav 1% Ca(N03 ) 2 0,1% KH2 P0 4 0,025% MgS04 0,025% FeS04 0,009% ZnS04 0,0003% KCl 0,0125% Csapvíz pH 5,6 NH4 OH-dal beállítva. A sterilezett táptalajt a Claviceps purpurea OKI 56/70. sz. törzs 6 hetes 40% szacharózt tartalmazó fenti táptalajon nőtt tenyészetének homogenizátumával oltjuk be. A tenyészeteket 25 °C hőmérsékleten tartjuk. Az öthetes felületi tenyészet papír- és rétegkromatográfiásan vizsgálva 80%-ban ergotamint és ergotaminint tartalmazott 20% vízben oldható alkaloid mellett. Összalkaloid-tartalom 1850 gamma/ml. 2. példa Az 1. példa szerinti előállított több tenyészet micéliumát összegyűjtve, 40 °C-on szárítottuk, porítottuk s ebből 200 g-ot 3x300 ml 80 °C forrpontú petroléterrel zsírtalanítottunk, majd a drogot 40 ml 3%-os BaC03 -oldattal eldörzsöltük, s ezután 3x300 ml acetonnal 24 órán át, 12, 6, 6 órás időközökben, megfelelő rázatással extraháltuk. Az egyesített extraktumokhoz 150 ml 3%-os o-foszforsavat adtunk, az acetont lepároltuk, s a maradék vizes oldat pH-ját 2%-os ammóniaoldattal 8-ra állítottuk, a kivált csapadékot szűrtük, 40 °C-on szárítottuk, s így 16 g nyersbázist kaptunk. Ebből 7 g-ot 200 g Brockman II aktivitású Al2C>3-oszlopra vittünk, s kloroformmal
