161589. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas proteáz enzim előállítására

MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS SZOLGÁLATI TALÁLMÁNY Bejelentés napja: 1971. VII. 16. (BI-397) Közzététel napja: 1972. V. 28. Megjelent: 1974. VI.13. 161589 Nemzatkózi osztalyotat: C 12 d 13/10 Feltalálóik) Aradi Csabáné vegyésztechnikus 4%, Avar Berta laboráns 4%, Encs Lászlóné laboráns 5%, Horváth Ferencné vegyésztechnikus, 5%, Kovács Lászlóné vegyésztechnikus 5%, Marossy Katalin oki. vegyész 13#>. Pintér László oki. vegyész, 9%, át. Pólya Kálmán biokémikus 12%, Szűcs Endréné oki. agrármérnök 12%, Végh Józsefné oki. agrármérnök 16%, Debrecen, Zalán György vegyész, 15%, Budapest Tulajdonos: BIOGAL Gyógyszergyár, 50%, Debrecen, Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Rt., 50%, Budapest. Eljárás savas proteáz enzim előállítására 1 A találmány tárgya eljárás savas proteáz előállítására, inclykultúrás tenyésztés útján, ahol a bioszintézist Aspergillus tlavus varietas proteolyticus törzs komplex táptalajon történő tenyésztése útján végezzük és a termelt exo- enzimet szűrés, vagy szűrés és vákuum bepárlás után ammóniumszuli'átos b kiesapással nyerjük ki. Az ipari és gyógyászati célra alkalmazható proteolitikus enzimeket eredetüktől függetlenül három alapvető csoportra szokás osztani. A felosztást a pH fehérjebontó aktivitási diagram alapján lúgos, neutrális és savas proteázként hasz- 10 náljuk. A savas proteázok elsődleges jellemző tulajdonsága, hogy hatásoptimumuk pH 2,6 6,5 közé esik, amely nem független a szubsztrát fehérje tulajdonságaitól. A savas proteázokat általában bioszintetikus eljárásokkal állítják elő és a bioszintézisre alkalmazott mikroorganizmus tenyész- ' tésénél felületi vagy süllyesztett kultúrás tenyésztést alkalmaznak. Ismeretes a Penicillium törzsekkel történő bioszintetizálás. a 931.635 és az 1,080.744 számú brit szabadalom alapján. 'Í0 A Rhisopus fajok egyes varietasainak különösen magas savas proteáz termelő képességéről számol be MATSUJLIMA, K: I Agr. Chem. Soc. Japán 32 215 (1958), majd a Rhisopus Chinenhis által termelt savas proteáz sajátosságait és tisztítási eljárásait ismerteti JUICHIRO FUKUMOTO (Agr. Biol.Chem. 25 Japán 31 710717 (1967). JIRO HOSH1NO az Aspergillus awamori savas proteáz termeléséről számol be. (BulLChem. Soc. Japán 32 71-74 (1959), Mem School Sei Eng. Waseda Univ. Tokyo Japan, 24 15-22 (1960)> (N.V.POPOVA egyik cikkében)Ferment Spirt Prom. 31. (5) 4-6 (1965) beszámol 30 más Aspergillus flavus törzsbof izolált savas proteázról, amelynek kitermelése és fajlagos aktivitása viszonylag alacsony. Az ismertetett eljárásokból és közleményekből meg- • állapítható, hogy a savas proteáz enzim előállítására n, Penicillium, Aspergillus és Rhisopus fajok alkalmazása az általánosabb. A tenyésztési eljárások megválasztásánál az ismert előnyök miatt a süllyesztett tenyésztési eljárást alkalmazzák ipari vonatkozásban. így a feladat olyan törzs megválasztása, amely lehetó'vé teszi a savas proteázok jellemző tulajdonságait viselő enzim magas hozamú termelését süllyesztett kultúrában. Az idézett fajok közül az Aspergillus-ok tenyészthetők legelőnyösebben süllyesztett kultúrában, nagy növekedési intenzitásuk miatt. Ezért a megfelelő termelékenységi sajátosságokkal rendelkező törzs izolálására vonatkozó munkák hazánkban főként Aspergillus fajok termelőképességének vizsgálatára terjedtek ki, amelyeket mezőgazdasági kultúrnövényekről izoláltuk. Egy kukorica növényről származó, különösen magas enzimaktivitású mutató aspergillus flavus törzs kiválasztása után az ebből előállított 60 mustárnitrogén muntáns közül szelektált legmagasabb termelőképességül, mely az eredeti törzs termelőképességét háromszorosan meghaladta, elneveztük Aspergillus flavus varietas proteolyticusnak. Az így izolált, majd nemesített törzs- mely tulajdonságait 12 generáción át stabilnak mutatta - második generációjából származó tenyészetet az Országos Közegészségügyi Intézet Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében 61. szám alatt 1971. évben letétbe helyeztük. Kísérleteink során célul tűztük ki, hogy olyan eljárást dolgoztunk ki, mellyel az optimális táptalaj, szaporítási hőmérséklet és kinyerési módszer alkalmazásával jó tulajdonságú és magas aktivitású savas proteáz enzimet kaptunk. A deponált törzs által termelt enzim pH-optimuma 4,0 -6,0 között legyen, szubsztráttól függően. Hemoglobin szubsztrát esetében a pH-optimum 5,0 a proteáz hőfok optimuma pedig 45 C". Kísérleteink alapján sikerült olyan eljárás kidolgozása, mellyel savas proteáz előállítható az általunk izolált törzs 161589