161589. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas proteáz enzim előállítására
161589 mély kultúrás tenyésztése útján, ahol táptalajként komplex táptalajt alkalmazunk, a táptalaj buzakorpát, tejsavóport, káliumkloridot, magnéziumszulfátot, káliumdihidrogénfoszfátot és dinátriumhidrofoszfátot tartalmaz és a tenyésztés 28-35 C° hőmérsékleten megy végbe. A bioszintézist követően szűrés, vagy szűrés és vákuum bepárlása után megfelelő mennyiségű ammónszulfáttal az exo-enzimet kicsapjuk és kinyerjük. Az így nyert enzim közvetlenül, vagy tisztítás után ipari, illetve gyógyászati célra felhasználható. • Az eljárás kivitelezését az alábbi példákon mutatjuk be: 1. példa: Az Aspergillus flavus variétas proteolyticus törzs összesen minimum 1,000.000 egyedet tartalmazó, 3 ml vízben elegyített spóraszuszpenzióját 50 g hántolt rizst 5 ml vizet tartalmazó steril táptalajba oltottuk, vattadugóval lezárt szűknyakú 500 ml-es Erlenmayer lombikokba. A mikroorganizmust és a táptalajt tartalmazó Erlenmayer lombikokat 6 napon át 28 C°-os helyiségben tartottuk és a tenyészeteket minden nap megráztuk, hogy a rizsszemek különállóan peregjenek. A tenyésztés befejezése után a tenyészet 46 milliárd spórát tartalmazott. A fenti spóramennyiséget 2 m3 -es vasfermentorbaelkészíteit I.U00 liter 2,0 % búzakorpát 1,0 % tejsavóport 0,5 % káliumkloridot 0,05 % magnéziumszulfátot 0,02 % káliumdihidrogénfoszfátot 0,1 % dinátriumhidrofoszfátot tartalmazó 4,5 pH-ju steril táptalajra oltottuk. A tenyészetet 42 órán át inokulummá növesztettük. A fenti inokulum tenyészet 10%-át a fentivel megegyező táptalajba oltottuk, majd 48 órán át növesztettük. Mind a fermentáció első, inokulum fázisát, mind a fermentáció második, termelő fázisát 28 C°-on tartottuk, 1 : 1 arányú levegőztetés mellett, 3,1 szulfiterteket biztosító keverést alkalmaztunk. A fenti módon nyert fermentléből a mycéliumot szűréssel távolítottuk el, majd a szűrtlevet * 5 C°-rahűtöttük, apH-ját 5,0-ra állítottuk, az enzimet 54% ammóniumszulfát segítségével kisóztuk, a kivált enzimet szűrtük, majd szári toMuk. A fenti eljárással 1 m* fermentléből 6,5 kg terméket állítottunk elő, melynek aktivitása 1,5 AE/g volt. 2. példa: 10 Az első példában leírt módon előállított a példában leírttal azonos inokulum tenyészet másik 10%-át az első példában leírttal megegyező táptalajba oltottuk, majd 48óráig növesztettük. A tenyésztési feltételek azonosak voltak az 1. példában közölt tenyésztési feltételekkel 15 Az így nyert fermentléből a mycéliumot szűréssel eltávolítottuk, majd a szűrtlevet 39-40 C°-on vákuumban az eredeti térfogatának 1/10 részére pároltuk. A bepároltlevet leszűrtük, • 5 C-ra hűtöttük és pH-ját 5,0-ra állítottuk. Az enzimet 49% ammóniumszulfát segítségével kisóztuk, a kisózott enzimet 20 kiszűrtük, majd szárítottuk Ezzel az eljárással 1 m3 fermentléből 5,9 kg terméket állítottunk elő, melynek aktivitása 1,5 AE/g volt. 25 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás savas proteáz enzim előállítására azzal jellemezve, hogy az Aspergillus flavus var. proteolyticus 00061 OKI 30 deponálási számú törzset sterilizált hántolt rizsszemeken tenyésztjük, majd a tenyészet segítségével a bioszintézist búzakorpát, tejsavóport, káliumkloridot, magnáziumkloridot, magnéziumszulfátot, dinátriumhidrogénfoszfátot tartalmazó táptalajon. 28C-on süllyesztett kultúrában vcge/zük. majd a 36 mikroorganizmustól elválasztott fermentléből pH 5,0 értéken >4/r aniniomums/ullat alkalmazásával az exocii/.unel kiso/.zuk és a kisózott terméket megszárítjuk. 2. Az 1. igénypontban leirt eljárás loganatosilasi moüja azzal jellemezve, hogy a kész fermentlé 1/10-ére való vákuum 40 hesú'rítése után az exoenzimet sűrítmény formájában alkalmazzuk, vagy a szilárd terméket pH 5.0 értékre állított sűrítményből 49 % ammóniumszulfáttal kisózzuk és a kisózott terméket megszárítjuk. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 730259, OTH, Budapest
