161577. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amiláz-inhibitor előállítására
161577 fentiek alapján arra következtethetünk, hogy az új amilázinhibitor polipeptid-vegyület. A legjobb inhibitor-készítmények gátló kapacitása sertéshasnyálmirigy-amilázzal szemben milligrammonként 700-800 hasnyálmirigy-aniitóz-inhibitor-egység (hasnyál- 5 mirigy-AIE), nyál-amilázzal szemben milligrammonként 900-1000 nyál-amiláz-inhibitor-egység (nyál-AIE). A találmány szerint előállított inhibitor nagy hasnyálmirigy-amilázgátló hatása (1. ábra A. görbe) következtében jelentős mértékben eltér a Kneen által leírt inhibitortól (Arc. Bioc- 10 hem. 9^235 (1946)3 Az ut<>bbi hatóanyag nyálamiláz-gátló kapacitása kb. 500 nyál-AIE(mg)tehát a találmány szerint előállított hatóanyag gátló kapacitásának közel a fele), ugyanakkor azonban a hasnyálmirigy-amilázzal szemben csak -csekély mértékű gátló hatást fejt ki [a gátló kapacitás 10 15 hasnyálmirigy-AIE/mg-nál kisebb érték 1, és még igen nagy dózisban sem gátolja 80%-nál nagyobb mértékben a hasnyálmirigy-amiláz aktivitását (1. ábra B. görbe). Egy amiláz- anhibitor-egység (1 AIE) az az inhibitor-mennyiség, amely egy amiláz-egység aktivitását 90%-ban 30 gátolja. [A definícióban azért alkalmazzuk a 90%-os gátlási értéket, mert az ehhez tartozó inhibitor-mennyiség interpolálással könnyen meghatározható!. Amint az 1. és 3. ábrán látható, a 100%-os gátlásnak megfelelő értéket a görbék aszimptotikusan érik el. Egy amiláz-egység az az enzim- 26 mennyiség, amely az alábbiakban ismertetésre kerülő kísérleti körülmények között egy perc alatt egy .ju-ekvivalens glükozid-kötést bont el a keményítőben. Az elbontott glükozíd-, kötések mennyiségének meghatározása során kolorimetriás úton, dinitroszalicilsawal meghatározzuk a képződött redu- 30 káló cukoi mennyiségét, és a kapott értéket maltóz-kalibráeiós görbe segítségével maltóz-egyenérték egységekben fejez*zük ki. A kísérletet a következőképpen hajtjuk végre: 0,1 ml amiláz-oldatot 120-22 AE/ml] 0-400 /*g inhibitorral és 0,4 ml pufferoldattal |0,02 m nátriumglicerofoszfát-oldat és 36 0,001 m kalciumklorid-oldat elegye, pH = 6,9 jelegy írünk, és az elegyet 10-20 percig 35 C°-os vízfürdőn tartjuk. Az elegyhez 0,5 ml 35 C-ra melegített 1%-os keményítő - oldatot adunk [a felhasznált oldható keményítő-a Merck, Darmstadt cég terméke, 1252 sz.], az elegyet 5 percig 35 C-on tartjuk, 40 végűi az elegyhez 1 ml dinitroszalicilsav-reagenst (P. Bernfeld, Colowick-Kaplan: Meth. Enzymol. 1. kötet 149. oldal] adunk. A színreakció kiváltása céljából az elegyet 5 percig forrásban lévő vízfürdőn tartjuk, majd lehűtjük és 10 ml .desztillált vízzel elegyítjük. Az oldat extinkcióját 540 nm 46 -hullámhosszon mérjük, hasonlóan kezelt, azonban amilázt nem tartalmazó vakpróbával szemben. Az eredmény értékelése során egy előzetesen felvett amiláz-kalibrációs görbe 'segítségével meghatározzuk az inhibitor hozzáadása után jelentkező amiláz-aktivitást, és a kapott értékből kiszámítjuk 50 - a százalékos aktivitásgátlást A százalékos aktivitásgátlást Ifg inhibitor* AE4 * tört függvényében ábrázoljuk; a kapott görbéről leolvassuk a 90%-os gátláshoz tartozó inhibitor-mennyiséget, és a kapott 68 értékből kiszámítjuk az AIE/mg inhibitor értéket. [Jelölések; = száraz anyagra vonatkoztatott érték; = azonos körülmények között vizsgált, inhibitort nem tartalmazó minta AE-értéke]. Az inhibitort a találmány szerint a következőképpen 60 'vonhatjuk ki búzalisztből, búzadarából, vagy búzasikérből: a) a kiindulási anyagot 10-90%-os, előnyösen 30-70%-os víz-alkohol eleggyel extraháljuk (alkoholként vízben oldódó, rövidszénláncú vegyületeket, így metanolt, etanolt, propanoic vagy izopropanolt alkalmazunk);vagy 66 b) a kiindulási anyagot híg, vizes elektrolit-oldatokkal, előnyösen pH - 1-5 értékű, célszerűen pH = 2-4 értékű híg vizes savakkal extraháljuk; vagy . c) a kiindulási anyagot az a) eljárásváltozatban ismertetett összetételű, azonban ásványi vagy szerves savat is tartalmazó, 70 pH = 1-6 értékű, előnyösen pH = 2-4 értékű víz-alkohol eleggyel extraháljuk. Az eljárás során 1 súlyrész búzalisztet, búzadarát, vagy búzasikért 1,5-5 súlyrész, előnyösen 2-4 súlyrész extrakciós oldattal elegyítünk, az elegyet 1-2 percig homogenizáljuk, 75 majd 0,5-4 órán át, előnyösen 1-2 órán át szobahőmérsék Jeten (20 - 25 C-on) keverjük. Az elegyet ezután szűrjük, vagy 10-20 percig 3000-6000 g értéken centrifugáljuk. A maradékot adott esetben 1-2 súlyrész extrakciós oldattal újból extraháljuk, és a kapott elegyet szűrjük, vagy centrifugáljuk. A centrifugáláskor kapott folyadékfázisokat ill. a szűrleteket egyesítjük, majd amennyiben az extrakciót savas oldattal végeztük - az elegyet célszerűen tömény vizes ammóniaoldattal semlegesítjük, és a semlegesítéskor kivált ballaszt-fehérjéket szűréssel elkülönítjük. A búzaliszt vizes extrahálásával előállított inhibitorral összehasonlítva - amely a nyál-amiláz aktivitását jelentősen, a hasnyálmirigy-amiláz aktivitását azonban csak kismértékben gátolja (lásd 3. ábra D. görbe) - a találmány szerinti, a), b), és c) eljárásváltozattal előállított kivonatok igen nagymértékű hasnyálmirigy-amilázinhibitor hatást fejtenek ki (lásd 3. ábra A., B. és C. görbe). A 3. ábrán búzaliszt 66%-os vizes etanollal (A. görbe), pH = 3 értékű vizes savoldattal (B. görbe), pH - 3 értékű, 30%-os savas vizes etanollal (C. görbe) és vízzel (D. görbe) végzett extrahálásával kapott oldatok 2,2 AE sertés-hasnyálmirigyamilázzal szemben meghatározót gátló hatását tüntetjük fel. Az egyes kivonatok előállítása során 1 súlyrész búzalisztet 1 órán át, 20 C-on 4 súlyrész extrahfidfolyadékkal kezeltünk. Az új amiláz- inhibitort előnyösen a c) eljárásváltozattál állítjuk elő, azaz a búzalisztet vagy búzasikért savas vizes alkohollal (30-70%ros vizes metanollal vagy etanollal, pH * 2-4 értéken) extraháljuk. Ezzel az eljárásváltozattal nagyobb hozammal vonhatjuk ki az inhibitort, mint az a) eljárásváltozat esetében, amikor extrakciós közegként semleges vizes alkoholokat alkalmazunk. A c) eljárásváltozat előnye a b) eljárásváltozattal szemben az, hogy az előbbi eljárás során kevésbbé viszkózus, könnyebben szűrhető, keverhető és centrifugálható elegyek képződnek. A c) eljárásváltozat további előnye, hogy az extrakció során a búzalisztben jelenlévő, nem inhibeálható amiláz nem kerül oldatba - ez az anyag az a) és b) eljárásváltozat esetén az inhibitorral együtt kioldódik -, ennek megfelelően nincs szükség a növényi amiláz inaktivilására vagy elkülönítésére. Ha búzaliszt helyett azonos mennyiségű búzasikérből indulunk ki, az új inhibitort 5-8-szor nagyobb hozammal állíthatjuk elő. Ha kiindulási anyagként búzasikért alkalmazunk, az előbbinél könnyebben szűrhető és centrifugálható extrakciós elegyek képződnek, és nagyobb fajlagos aktivitású amiláz-inhibitort kapunk. A következőkben az inhibitor elkülönítését ismertetjük az . extrakciós elegyekből. A b) és c) eljárásváltozatban az inhibitor elkülönítése előtt az elegyet semlegesítjük. A kivonatot csökkentett nyomáson (10-20 Hgmm), 40 C°-ig terjedő hőmérsékleten eredeti térfogatának kb. 1/5-1/lfrére bepároljuk. A koncentrátumot szűrjük vagy centrifugáljuk, az átlátszó szűrletet ill. folyadékfázist sómentesítjük, majd liofilizáljuk. B. Eljárhatunk úgy is, hogy az inhibitort acetonnal kicsapjuk az extrakciós elegyből. Ezt az eljárásváltozatot elsősorban a nagy alkoholtartalmú (60%-nál nagyobb mennyiségű alkoholt tartalmazó) kivonatok esetén alkalmazhatjuk, ekkor ugyanis az inhibitor viszonylag kismennyiségű acetonnal is teljes mértékben kicsapható. 1 térfogatrész kivonathoz a kivonat alkoholtartalmától függően 2-4 térfogatrész aceton t adunk, a kivált inhibitort leszűrjük, absz. alkohollal fnossuk, és szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. C. Egy további eljárásváltozat szerint az inhibitort rövid-szénláncú alkoholokkal csapjuk ki az adott esetben betöményített extrakciós elegyből. Az elegyhez annyi etanolt, n-propanolt vagy izopropanolt adunk, hogy alkoholtartalma 95, 90 ill. 80 térf.% legyen. Az amiláz-inhibitort 95%-os metanollal is kicsaphatjuk, ekkor azonban a terméket az előbbinél kisebb hozammal különíthetjük el. Tekintettel arra, hogy kisebb alkoholkoncentráció esetén at inaktív kisérőanyagok (pl. fehérjék) kiválnak, a fenti módszerrel frakcionált kicsapást is végezhetünk. D. Az amiláz-inhibitort kisózással is elkülönítheti ük az adott esetben betöményített extrakciós elegyekből. A kisózáshoz pL nátriumkloridot, ammóniumszulfátot vagy hasonló: vegyületeket használhatunk fel. 2
