161577. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amiláz-inhibitor előállítására

5 161b/, 6 E. Egy további eljárásváltozat szerint a meghatározott alkoholtartalmú kivonatokból alacsony hőmérsékleten csapjuk ki az amiláz-inhibitort. A kiindulási elegy alkoholtartalmát 10-50%, előnyösen 20-40% értékre állítjuk be, majd az elegyet hosszabb ideig (8-24 órán át) 0 C° alatti 5 hőmérsékleten, előnyösen -10 és -20 C° között tartjuk. Ezalatt az inhibitor teljes mértékben kiülepedik, és a felső folyadékréteg elönthető. A csapadékot -10 és -20 C közötti hőmérsékleten centrifugáljuk, majd az üledéket azonnal absz. etanollal vagy absz. izopropanoUal mossuk. A 10 mosást célszerűen alacsony hőmérsékleten (kb. 0 C-on) végezzük, és 1 térfogatrész üledékhez kb. 10 térfogatrész absz. etanolt ill. kb. 5 térfogatrész absz. izoprppanolt használunk fel. Az inhibitort szobahőrmésékleten, előnyösen vákuumban szárítjuk. A fenti eljárással különböző hőmérsék- 15 leteken frakcionált kicsapást is végezhetünk. Ismeretes, hogy az állati és emberi szervezetben a szénhidráttartalmú táplálékok (pl. gabonakeményítő, burgonyakeményítő) elfogasztása után táplálkozási hiperglükémia lép fel, ami azzal magyarázható, hogy a szénhidrátok az amiláz 20 ;(nyál- és hasnyálmirigy-amiláz) és maltáz hatására a keményítő amiláz

maltáz ill. glikogén maltóz glükóz reakciósornak megfelelően, viszonylag gyors ütemben glü- 25 kózzá alakul. Ez a vércukorszint-növekedés különösen erős és? hosszantartó a cukorbetegek esetében. A táplálkozási hiperglükémia következtében elhízott embereknél gyakran lép fel erős inzulinszekréció, amely a zsírbeépülés fokozódását és a zsírleadás csökkenését eredményezi. 30 A találmány szerint előállított amiláz-inhibitort hat egészséges vizsgálati személynek adtuk be. Azt tapasztaltuk, hogy amiláz-inhibitor jelentős mértékben csökkenti a búzakeményítő- terhelés után fellépő táplálkozási hiperglükémiát. A fentieknek megfelelően a találmány szerint előállított amiláz- 35 inhibitort a gyógyászatban az elhízás, érelmeszesedés, a cukorbaj és a látens cukorbaj kezelésére használhatjuk fel. A hatóanyagot tabletták, drazsék, oldatok, szuszpenziók, granulák formájában, vagy keményítőtartalmú élelmiszerek adalékanyagaként adhatjuk be napi egyszeri vagy többszöri, 40 5000-1 000 000 AIE mennyiségű hatóanyagot tartalmazó orális dózisban, étkezés előtt és/vagy étkezés alatt. / A találmány szerint előállított inhibitor toxicitása igen kis érték. Egereken 1,7 .10* hasnyálmirigy-AIE/testsúly kg mennyiségű hatóanyag orális beadása esetén nem észleltünk 45 kóros elváltozást A találmány szerint előállított inhibitort előnyösen alkalmazhatjuk egyéb, orálisan beadható antidiabetikumokkal [0-citotróp szulfonilkarbamid- származékokkal és/vagy vércukorszint- csökkentő hatású bjguanidokkal] elegyítve is. 60 A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása tnélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. . t wo 1. példa \ 1 kg búzalisztet 2 liter 66%-os savas vizes etanollal (pH = 3-3,5) elegyítünk, az elegy pH-értékét sósavval 3-3,5-» állítjuk, majd 30 percig szobahőmérsékleten keverjük. Az 60 elegyet ezután 20 C-on 10 percig 6000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, a folyadekfazist elkülönítjük, és a maradékot ismét 2 liter 66%-os savas vizes etanollal (pH = 3-3,5) extraháltuk. A centrifugáláskor kapott folyadékfázisokat egyesítjük, tömény vizes ammóniaoldattal semlegesít- 65 jük, és a kivált ballaszt-fehérjéket centrifugálással (6000 g, 10 perc) elválasztjuk. A kapott 2,8 liter, enyhén sárgás folyadékfázist kb. 20 Hgmm nyomáson, 40-50 C° fürdőhőmérsékleten térfogatának kb. tizedrészére (300 ml) bepároljuk, a kivált fehérjéket centrifugálással elkülönítjük, a folyadék- 70 fázist 8 órán át szobahőmérsékleten desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd fagyasztva szárítjuk. 10 g, grammonként 140 000 hasnyálmirigy-AIE mennyiségű inhibitort tartalmazó liofilizált terméket kapunk [- 7,5 g száraz, 185 000 hasnyálmirigy-AIE/» hatóanyagtartalmú inhibitor). 75 2. példa Starmix keverőberendezésben 1 kg búzalisztet 4 liter 30%-os vizes etanollal homogenizálunk, az elegyet sósavval pH = 3-3,5 értékre savanyítjuk, majd 60 percig szobahőmérsékleten keverjük. Az elegyet 10 percig 6000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, a folyadékfázist tömény vizes ammóniaoldattal pH = 6,8 értékre semlegesítjük, és a kivált ballaszt-fehérjéket centrifugálással elkülönítjük. Az átlátszó folyadékfázist éjszakán át -15 C-on tartjuk, majd a felső, átlátszó oldatot dekantáüssal elválasztjuk, a kivált üledéket előre hűtött centrifugacsövekbe töltjük, és Zeta-20 típusú hűtőcentrifugán 10 percig 6000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A terméket jéghideg absz. etanollal elegyítjük, majd szobahőmérsékleten szűrjük, absz. etanollal mossuk és vákuum-szárítószekrényban szárítjuk. 10 g, grammonként 160 000 hasnyálmirigy-AIE mennyiségű hatóanyagot tartalmazó terméket kapunk [ = 8g száraz, 200 000 hasnyálmirigy-AIE/g hatóanyagtartalmú inhibitor]. 3. példa 200 g lisztet 800 ml vízzel elegyítünk, az elegyet sósavval pH = 3,3 értékre savanyítjuk és 30 percig szobahőmérsékleten beverjük. Az elegyet 30 percig 10 000 g gyorsulással centrifugáljuk, a zavaros folyadékfázist ammóniával semlegesítjük, és ismét 30 percig 10 000 g gyorsulással centrifugáljuk. A kapott 600 ml, zavaros folyadékfázishoz 1100 ml absz. alkoholt adunk, az elegyet szűrjük, és az inhibitort további 5 liter absz. etanollal kicsapjuk a szürietből. A terméket absz. etanollal mossuk és vákuumban szárítjuk. 1,5 g, grammonként 90 000 hasnyálmirigy-AIE mennyiségű hatóanyagot tartalmazó terméket kapunk. 4. példa 500 g búzalisztet 2 liter 75%-os vizes metanollal elegyítünk, az elegyet 2 percig homogenizáljuk, 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd két nagyméretű redős szűrőn szűrjük. A kapott, 1,6 liter térfogatú, átlátszó szűrletet 4 térfogatrész (=6,4 liter) acetonba csepegtetjük keverés közben. Az inhibitor »sűrű, fehér pelyhek alakjában kiválik. Az átlátszó felső folyadékréteget dekantálással elválasztjuk, a fehér üledéket absz. etanolban felvesszük, mossuk és szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. 12 g, grammonként 40 000 hasnyálmirigy-AIE mennyiségű hatóanyagot tartalmazó terméket kapunk. 5. példa A találmány szerint előállított amiláz-inhibitor vércukorszint-csökkentő hatását az alábbi kísérlettel igazoljuk: A kontroll- kísérletben hat egészséges vizsgálati személynek orális úton, vizes szuszpenzió alakjában 100 g gabonakeményítőt adtunk, majd közvetlenül a keményítő beadása után, és ezt követően 3 órán át rövid időközönként meghatároztuk a vizsgálati személyek vércukorszintjét. A meghatározást Autoanalyzer/TechniconRműszerrel végeztük, Hoffman módszerével [J.Biol. Chem. 120 51 (1937)]. Két további kísérletsorozatban a fenti hat vizsgálati személynek közvetlenül a keményítő beadása előtt, orálisan tragant-nyákkaj elegyített amiláz-inhibitort adtunk, majd a fent ismertetett módon ismét meghatároztuk a vizsgálati személyek vércukorszintjét. A kísérletek eredményeit az 1. táblázatban ismer1 tétjük. 1.táblázat Hat egészséges vizsgálati személy vércukorszintjének a kezdeti értékhez viszonyított %-os változása (átlagérték ± 1 s) az orális gabonakeményítő-terheléstől számított meghatározott idő elteltével, előzetes amiláz-inhibitor-kezelés esetén. 3