161479. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glutaminsav és/vagy aszparaginsav- komponenseket tartalmazó polipeptidek szintézisére
3 161479 4 nosavakat tartalmazó polipeptideket, pl. az alábbi 1—67 heptahexakontapeptidamidot H-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-123456789 10 -Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-Leu-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 -Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leue-Glu-Pro-Val-Glu-21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 -Phe-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu-Ala-Phe-31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 -Asp-Thr-Tyr-Glu-Glu-Phe-Glu-Glu-Ala-Tyr-4.1 42 43 44 45 46 47 48 49 50 -Ile-Pro-Lys-Glu-Gln-Lys-Tyr-Ser-Phe-Leu-51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 -Gln-Asp-Pro-Glu-Thr-Ser-Leu-NH2 61 62 63 64 65 66 67 vagy ennek részeit olyan módon állítjuk elő, hogy a kijelölt szintézis-komponensekben az alkotó aminosavak oldallánc-funkciói közül csak a lizin e-aminocsoportokat védjük a szintézis teljes idejére, míg a glutaminsav és aszparaginsav részek ro-karboxilcsoportjainak legalább 30%-át szabadon hagyjuk. Ugyanakkor az intermedier peptidek előállítása során az oldallánc-funkciókat olyan mértékben védhetjük, amilyen mértékben az izolálásuk, tisztításuk szempontjából előnyös, és nagyobb peptidekké történő azidos összekapcsolásuk előtt távolítjuk el a glutaminsav és aszparaginsav részek a>-karboxil-csoportját védő szubsztituenst, valamint az esetleg jelenlevő egyéb oldallánc-funkciót védő szubsztituenst — a lizin-e-amino-védőcsoport kivételével. Az intermedierek azidos kondenzációjánál az azid- és aminokomponenst vizes dimetilformamidban reagáltatjuk. Az a-aminocsoportok átmeneti és a lizin-e-aminocsoportjainak permanens védésére — a peptidszintézis általános elveinek megfelelően — bármilyen egymástól szelektíven eltávolítható szubsztituenst, pl. a karbobenzoxi- és terc.butiloxikarbonil-csoportokat is használhatjuk. Az a>-karboxil-csoportok átmeneti védésére pedig választhatjuk a nagyon előnyös terc.-butilészter formát, Ha a találmány szerinti eljárással kívánjuk előállítani a fentebb jelölt 1—67 polipeptidet, akkor előnyösen úgy járunk el, hogy a szintézis komponenseit az 1—5, 6—13, 14—20, 21—26, 27—32, 33—39, 40—43, 44—49, 50—56 és 57—67 szekvenciarészekből alakítjuk ki oly módon, hogy a glutaminsav- és aszparaginsav részek cj-karboxil-csoportját a szintézis teljes idejére csak az 54. glutaminsav esetében védjük (ami az 50—54 komponensben levő Lys részek miatt előnyös), a többi co-észter-csoportot a komponensek összekapcsolása előtt eltávolítjuk. Természetesen a felsorolt komponensek felhasználásával kisebb fragmenst, pl. az 1—56 molekularészt is előállíthatjuk, akkor azonban az 56. lizin rész az 50—56 komponensben nem metilészter vagy hidrazid, hanem savamid vagy szabad sav formában van jelen. Az 57—67 komponenst H-Tyr-Ser-Phe-Leu-Gln-Asp-Pro-Glu-Thr-Ser-Leu-NH2 formában használjuk fel. A szabad undekapeptidamidot a megfelelő, N-terminálisán pl. karbobenzoxi csoporttal és az f/j-karboxil csoportokon terc.-butilészter csoporttal védett undekapeptidamidból nyerjük, amit előnyösen lépésenkénti szintézissel (stepwise szintézissel) építünk fel leucinamidból kiindulva. Lépésenkénti szintézissel készítjük a 40—43 védett tetrapeptidhidrazid-komponenst Z-Phe-Asp-Thr-Tyr-NHNH2 (a képletben és az alábbi képletekben használt rövidítések: Z = karbobenzoxi csoport, ZN = p-nitrobenzilóxikarbonil csoport, BOC = terc.-butiloxikarbonil csoport, OtBu = terc.-butoxi csoport, OPCP = pentaklórfenoxi csoport; a zárójelbe tett rövidítések az w-funkción levő helyettesítőt jelzik) formában, a 33—39 heptapeptid származékot Z-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu-Ala-NHNH2 formában, melyet azonban nem a C-terminális alanin metilészteréből, hanem terc.-butiloxikarbonil-hidrazidjából (H-Ala-NHNH-BOC) kiindulva készítünk el. Hasonlóan stepwise szintézissel készülhet a 27—32 hexapeptid komponens ZN-Glu-Pro-Val-Glu-Phe-Ala-NHNH2 formában és a 21—26 hexapeptid-származék ZN-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-NHNH2 formában. Az 50—60 azid-komponenst a Z-Tyr-Ile-Pro-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Gln-Lys(BOC)-NHNH2 heptapeptid-származékból nyerjük, s ezt pedig a megfelelő metilészter hidrazinolízisével készítjük. A védett heptapeptidésztert előnyösen a Z-Tyr-Ile-Pro-OPCP és H-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Gln-Lys(BOC)-OMe peptid-származékok kondenzációja eredményezi. Az utóbbi peptidek a C-terminális aminosavtól elinduló stepwise szintézissel állíthatók elő. A HGH 1—56 fragmensének előállításához szükséges 50—56 komponenst H-Tyr-Ile-Pro-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Gln-Lys(BOC)-NH2 alakban használjuk fel, mely vagy úgy készülhet, hogy a megfelélő tetrapeptid eleve amid formában van (H-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Gln-Lys-(BOC)-NH2 ) vagy úgy, hogy a heptapeptidésztert alakítjuk ammonolízissel amiddá. Mindegyik esetben az N-terminálison is védett heptapeptidamid karbobenzoxi csoportját hidrogenolízissel eltávolítjuk, s ekkor keletkezik a kívánt H-Tyr-Ile-Pro-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Gln-Lys(BOC)-NH2 komponens. A 14—20 ZN-Met-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-Leu-NHNH9 heptapeptid-komponenst a megfelelő észter hidrazinolízisével állítjuk elő, ezt pedig az N-terminális dipeptidazid és a C-terminális pentapeptidészter kondenzációjával nyerjük. A pentapeptidészter karbobenzoxi-származéka a Z-Arg-OH és a H-Ile-Ser-Leu-OMe vegyes anhidrides kondenzációjával készül. A tetrapeptidészter N-karbobenzoxi származékát a Z-Ue-Ser-NHNH2 és a H-Leu-Leu-OMe azidos kapcsolásával állítjuk elő. A 6—13 ZN-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-NHNH2 komponenst előnyösen három fragmensének kondenzációjával állíthatjuk elő. A C^ -terminális és a középső rész, a H-Asp-Asn-Ala-NHNH-BOC, illetve a Z-Arg-Leu-Phe-NHNH2 kapcsolásával nyerjük a megfelelő hexapeptid-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
