161454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cisztintartalmú peptidek előállítására
7 181454 8 2. példa "terméket leszivatjuk. Ezt etilacetátban oldjuk és az oldatot 5%-os citromsavoldattal, majd vizzel mossuk. Ezután jéghú'tés közben a pn-nitrofenol eltávolítása céljából ötször 5%-os káliumkarbonát oldat - 5%-os káliumbikarbonát oldat 1:1 aránvu eleavéveL majd vizzel mossuk. Az etilacetátos oldatot 6 szárítva, majd bepárolva gyantás termék marad vissza. A szilárd porként : ,,. keletkezett tetrapeptid származék 181-182°-on olvad; [a]£ =-ll°(c=2,09, metanolban). Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf43A =0,57; Rf etilacetátban=0,10; Rf toluol-aceton 10 (7:3) elegyben =0,05; Rf kloroformmetanol (9:1) rendszerben =0,45. 16)BOC-Cys-(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-NH~NH1 7,0 g BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe vegyü- ,6 letet 70 ml metanolban oldunk és a 0°-ra lehűtött oldathoz 7 ssl hidrazinhidrátot adunk. 16 óra múlva 2°-on 600 ml jéghideg 2-n ecetsavoldatot adunk hozzá, a kocsonyás csapadékot jól eldörzsöljük, leszivatjuk és bő vízzel semlegesre mossuk. A keletkezett port ; 40°-on vákuumban szárítjuk, 20 majd 100 ml acetomtrilben szuszpendáljuk. Eldörzsölés után leszivatjuk és 40°-on vákuumban szárítjuk. A keletkezett BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-NH-NH3 216-218°-on olvad. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat *° során a következő Rf értékeket kapjuk: Rf=0,55 dioxán-viz (98:2) rendszerben; RF=0,5 2 kloroform-metanol (8:2) elegyben; Rfio2E=0,70. 17) BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Am~Leu-Ser(tBu)-Thr (tBuj- 30 Cys(TRI)- Val-Leu-OH -15° hőmérsékleten 1,075 g (1,26 mmól) BOC-Cys(TRI) -Ser(tBu>Asn-Leu-NH-NH, 15 ml dimetilformamidos oldatához 1,71 ml etilacetátos sósavoldatot (1,84-n; 3,15 mmól) és 0,174 ml (1,51 mmól) tercier-butilnitrit (1,74 ml-t ^ 1 ml tercier-butilnitrit dimetilformamiddal 10 ml-re töltött oldatából) adunk hozzá. Az oldatot 15 percig -10°-on keverjük, majd -12°-ra hűtött 1,104 g (1,26 mmól) H-Ser (tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH és 0,61 ml (4,41 m mmól) trietilamin 15 ml diemtilformamidos oldatát csepegtetjük hozzá. A reakcióelegyet egy órán át -10°-on és négy órán át szobahőmérsékleten keverjük. Nagy vákuumban kis térfogatra bepároljuk, és víz hozzáadásával por alakú terméket kapunk, amelyet vízzel kétszer eldörszölünk, majd 45 nagy vákuumban kálilúg felett szárítunk. 50°-on telített metanolos oldatból egy éjszaka alatt fehér por válik ki, amely vékonyrétegkromatogramon egységesnek mutatkozik. SzUiksgek'n végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf43C =0,54; Rfj2iA= 0,65;Rf 4s =0,50,;Riy, =0,75; KI 50 öoroform-metanol (8:2) rendszerben'= 0,40. 55 BOC-Cys-Asn-OtBu \ BOC-Val-Cys-Gly-Glu(OtBu)ä (I) 172 mg (0,2 mmól) BOC-Val-Cys'íTR^-Gly-GlutOtBu), és 128 mg BOC-Cys(TRI)-Asn-OTBu 5 ml etilacetátos és 2 60 ml metanolos oldatához 254 mg (1 mmól) jód 5 ml metanolos oldatát adjuk, és az oldatot egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután 0°-on In tioszulfitoidattal elszinteknítjük, a reakcióelegyet 200 ml etilacetátban felvesszük és vizzel háromszor mossuk. A (nátrium- 6S szulfáttal szárított) etilacetátos oldatot bepárolva [BOC-Cys -Asn-OtBuL kristályosodik ki (32 mg, Op.: 194-196°), . amelyet leszűrjük. A szűrletet szárazra pároljuk és a maradékot petroléterrel kétszer eldörzsöljük. Az oldhatatlan maradékból szüikagéles kromatográfiával 90 mg (il) vegyületet 70 Sápunk. Ezt szüikagéles vékonyrétegkromatográfjával vizsgálva kloroform-metanol (95:5) rendszerben Rf=0,25; és toluol-aceton (1:1) rendszerben Rf=0,30 érték adódik. Oszlopkromatográfiás eljárással másik termékként 54 mg JBOC-Val-Cys-Gly-Glu(OtBu), ], vegyületetet kapunk.?s Rf (szilikagélen) kloroform-metanol (9:1) rendszerben=0,55. A fentemlített 194-196° olvadáspontu kristályos dimer a következő Rf értékeket adja: kloroform-metanol (9:1) elegyben Rf=0,25; toluolaceton (1:1) rendszerben Rf=0,18. A kiindulási peptideket a következőképpen állítjuk elő. 1) Z-Asn-OtBu 32 g (120 mmól) Z-Asn-OH vegyületet 600 ml dioxánban oldunk és -30°-on 300 ml izobutilént vezetünk az oldatba. 12 ml koncentrált kénsav hozzáadása után a lombikot lezárjuk és időnkénti rázogatással 20 órán át 0°-on állni hagyjuk, amik oris tiszta oldat keletkezik. A továbbiakban ebből szobahőrmésékleten eltávolítjuk a felesleges izobutilént A keletkezett oldathoz Q°-on 44 g káliumbikarbonát vizes oldatát adjuk és kis térfogatra bepároljuk, majd etilacetátban felvesszük. A nátrium szulfáttal szárított etilacetátos oldatot párolva a termék elkezd kikristályosodni. Még n-hexánt csepegtetünk hozzá és leszűrjük. Op.: 100-102°- [a] |3 = _ 16 ° (c , 2, metanolban). "Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatban az Rf érték toluol-aceton (7:3) rendszerben =0,27; etilacetátban=0,43. 2) H-Asn-OtBu 23,6 g (73,2 mmól) Z-Asn-OtBu vegyületet, 200 ml etilacetátos közegben 2 g Pd-szén (10%-os) katalizátor jelenlétben hidrogénezünk. 1 óra múlva megszűnik a hidrogénfelvéteL A katalizátort leszűrjük, a szürletet bepárolva a termék kikristályosodik. Op.: 96-98°; [0)0=* 2° (c=2,l metanolban). 3) BOC-Cys(TRIj-Asn-OtBu 18,52 g (40 mmól) BOC-Vys(TRI)-ÖH és 5,6 ml (40 mmól) trietilamin 200 ml tetrahidrofurános oldatához -10°-on 5,32 ml (40 mmól) klórhangyasav izobutilésztert adunk és 10 percig ezen a hőmérsékleten keverjük. -10°-ra lehűtött 7,52 g (40 mmól) H-Asn-OtBu 150 ml tetrahidrofurános oldatát csepegtetjük hozzá és az elegyet 1 órán át -10°-on, majd egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután leszűrjük a kivált trietilaminhidrokloridtól, a szűrletet szárazra pároljuk, a maradékot etilacetátban felvesszük és In citromsawal, In nátriumbikarbonáttal és vizzel mossuk. Az etilacetátos oldatot bepárolva és petrolétert adva hozzá a termék kikristályosodik.1 Op.: 155-157° [«]" =»34° (c*2,l kloroformban). Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során toluol-aceton (1:1) rendszerben az Rf érték=0,45; kloroform-metanol-(95:5) rendszerben RHK33; Rf41A = 0.65. 4) Z-Gly-Glu(OtBu)2 23,2 g (0,11 mól) és 15,54 ml (0,11 mól) trietilamin 200 ml tetrahidrofurános oldatához - 10°-on 14,97ml(0,llmól) ' klórhangyasav izobutilésztert adunk és 10 percig -10°-on állni hagyjuk. 28,52 g (96,5 mmól) H-Glu(OtBu)f .HCl és 13,5 ml (96,5 mmól) trietilaminhidroklorid elegyének 300 ml tetrahidrofurános oldatát megszűrjük a trietilamin-hidrokíoridtól, a szűrletet -10°-ra hűtjük és -10°-on a fenti oldathoz csepegtetjük. További egy órán át -10°-on, majd 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, a kicsapódott trietilaminhidrokloridot leszűrjük és a szűrletet szárazra pároljuk. A keletkezett olajat etilacetátban felvesszük, és In citromsavval, In nátriumbikarbonáttal és vízzel mossuk. Az etilacetátot lepárolva kapjuk a peptidszármazékot, amely etil.acetát-n-hexán elegyből kikristályosodik. Op.: 74-76°; [agf=-17° (c=2,2 metanolban). Szüikagéles vékonyrétegkromatogramon toluol-aceton (7:3) rendszert alkalmazva Rf*0,50. 5)H-Gfy-Glu(OtBuj2 2,7 g (6 mmól) Z-Gly-Glu(OtBu)2 vegyületet 30 ml etilacetátos közegben 250 mg Pd-szén (10%-os) katalizátor jelentótében hidrogénezünk. 4 óra múlva befejeződik a hidrogénfelvéteL Ekkor az oldatot megszűrjük a katalizátortól és bepároljuk. A terméket olajos formában kapjuk, és ez a vékonyrétegkromatográfia alapján egységes. Rf értékek (szilikagélen): toluol-aceton (7:3) rendszerben=0,27, kloroform-metanol (9:1) rendszerben=0,37; Rf4 3 A =0,50.
