161454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cisztintartalmú peptidek előállítására
9 161454 10 6) TRI-Cys-(TRI)-Gly-Ght(OtBu) t 22,0 g (44 mmol) TRI-Cys(TRI)-OH és 13.9 g (44 mmol) H-Gly-Glu(OtBu), 350 ml etilacetátos oldatához 0°-on 9,06 g (44 mmol) diciklohexilkarbodümidet adunk, 2 órán át 0°-on keverjük és egy éjszakán át hűtőszekrényben állni hagyjuk. Ezután leszűrjük a kicsapódott diciklohexilkarbamidot, a szűrletet In citromsavval, In nátriumbikarbonáttal és vízzel mossuk, az oldatot szárítjuk és bepároljuk. A termék n-hexán-etilacetát elegyből kikristályosodik. Op.: 107-110°[a]£f =»8° (c=2,0 metanolban). Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal toluol-aceton (7:3) elegyben Rf=0,70; kloroformmetanol (98:2) rendszerben Rf=0,78. 7) H-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)1 3,156 g (3,5 mmol) TRl-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu) 4 20 ml jégecetes oldatához szobahőmérsékleten 5 ml vizet adunk úgy, hogy a keletkezett csapadék azonnal újraoldódjon. Kb. 10 perc múlva zavarosodás és csapadék kiválás jelentkezik. 1 óra hosszat keverjük, majd 15 ml vizet adunk hozzá és leszűrjük. A szűrletet nagy vákuumban 40°-on bepároljuk, a maradékot etilacetátban felvesszük és 0°-on 0,5n nátriumbikarbonát oldattal és vízzel mossuk. A bepárlás során keletkezett habot petroléterrel eldörzsöljük. A termék szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás eljárással kloroform-metanol (95:5) rendszerben Rf=0,40; toluol-aceton (1:1) rendszerben Rf=0.55 értéket ad; Rf43A=0,60. 8) BOC-Vat-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)J 7,17 g (33 mmól) BOC-Val-OH és 4,62 ml (33 mmól) trietilamin 80 ml etilacetátos oldatához -10°-on 4,4 ml (33 mmól) klórhangyasav izpbutilésztert adunk és 10 percig -10°-on keverjük. - 10°-ra hűtött 21,92 g (33 mmól) H-Cys(TRl)-Gly-Glu(OtBu)2 400 ml etilacetátos oldatát csepegtetjük hozzá és az elegyet még egy óráig -10°-on, és 10 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Ezután szárazra pároljuk, a maradékot, , 2x200 ml vizzel eldörzsöijuk és foszforpentoxid felett szárítjuk. A maradékot 450 ml forró metanolban oldjuk. 'A termék egy éjszaka alatt 0°-on kikristályosodik. Op.:213-215°. Sa]^- =*19° (c=2,2 kloroformban.) Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal az Rf értékek: ciklohexán-etilacetát (1:1) rendszerben Rf = 0,18; toluol-aceton (1:1) rendszerben Rf=0,65. 3. példa 172 mg (0,2 mmól) BOC-Vaí-Cys (TRI-) íí-Gly-GluíOtBu), 5 ml etilacetátos és 2 ml metanolos oldatát 127 mg (0,5 mmól) jód 2,5 ml metanolos oldatával "elegyítjük, és a reakcióelegyet 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldatot ezután 1 n tioszulfáttal elszintelenítjük. 200 ml etilacetátban felvesszük és vazel háromszor mossuk. Az etilacetátos oldat bepárlása során keletkezett terméket kétszer petroléterrel eldörzsöljük. A petroléterben oldhatatlan [BQC-Val-CyS-Gly-Glu (OtEu), ] a vékonyrétegkromatográfia szerint egységes. Termelés: 123 mg (100%). 4. példa BOC-Cys-Tyr(tBu)-!le-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH, 620 mg jód 150 ml metanolos oldatához 25°-on erős keverés közben 500 mg BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-ile- Gln-Asn-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-NH, 100 ml metanolos oldatát adjuk, 45 perc alatt hozzácsepegtetve. Egy órán át tovább keverjük, majd az oldatot 5°-ra hűtjük, és In nátriumtioszulfát-oldat hozzáadásával elszintelenítjük. Ezután az oldatot viz sugárszivattyúval létesített vákuumban kb. 5 ml térfogatúra pároljuk be, és a terméket sok viz hozzáadásával kicsapjuk. Leszivatjuk és vákuumben nátriumhidroxid felett szárítjuk. A szabad oxitocinná való átalakítás céljából a terméket 5 ml jéghideg koncentrált sósavban szuszpendáljuk, és keverés közben oldjuk. 10 perc múlva 0°-on az oldatot 20 ml jeges vízzel hígítjuk, 5 ml jégecetet adunk hozzá, gyengén bázikus, acetát formájú II számú Merck ioncserélőgyanta oszlopon szűrjük, és 20%-os ecetsavval utánamossuk. Ezután vákuumban 30 -on bepároljuk, a maradékot vízben oldjuk és az oldatot liofilizáljuk. Az így keletkezett oxitocint, ha szükséges, a Yamashiro (Nature 201, 76 (1964)) által leírt eljárással tovább tisztíthatjuk. A kiindulási anyagként alkalmazott védett BOC-Cys (TRD-Tyr-(tBuHle-Gln-Asn-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-NH, monopeptidszármazékot a következőképpen állíthatjuk elő: 1} TRI-Cys-(TRI)-Pro-Leu-Gly-NH2 30 g H-Pro-Leu-Gly-NH, , ,, vegyületet 500 ml frissel desztillált dimetilformamidban oldunk és az 5°-ra lehűtött oldatot 70 g TRI-Cys(TRI)-OH vegyülettel, 20 g N-hidroxiszukcinimiddel és 30 g diciklohexilkarbodiimíddel egyesítjük. 30 perces 0°-on történő állás után szobahőmérsékletre melegítjük, és 18 i óráig állni hagyjuk. Ezután a kivált diciklohexilkarbamidtól leszivatjuk, a szűrletet nagy vákuumban 40°-on bepároljuk és a maradékhoz 1 liter petrolétert adunk. Az oldhatatlan tennék alapos eldörzsölése után a petroléteres oldatot dekantáljuk. A petroléterben oldhatatlan anyagot etilacetátban felvesszük, és az oldatot 0°-on híg citromsavoldattal, vizzel, nátrium bikarbonát oldattal és vizzel mossuk, nátriumszulfáttal szárítjuk és szárazra pároljuk. Az így keletkezett nyers TRI-CYs(TRI)-Pro-Leu-Gly-NHa tetrapeptid származékot tisztítás céljából metanolban oldjuk és Sephadex LH-20 oszlopon szűrjük. A keletkezett frakciókat bepároljuk és tisztaságukat szilikagéles vékonyrétegkromotográfiával kloroform-metanol (99:1) rendszerben megvizsgáljuk. A tiszta frakciókat egyesírjük, bepároljuk és szárítjuk. 2) H-Cys(TRI)-Pro-Leu-GIy-NH2 ' Az Na -TRI csoport lehasítása céljából 5 g TRI-CysCTRI) -Pro-Leu-Gly-NH3 vegyületet 100 ml 80%-os ecetsavban oldunk és az oldatot 1 órán át 35°-on állni hagyjuk. Eütán 100 ml vizet adunk hozzá, és 5 órán át 0°-on tartjuk. A kicsapódott trifenilkarbinol kristályokat leszivatjuk, a szűrletet szárazra pároljuk és a maradékot nagy vákuumban 30°-on szárítjuk. A szabad bázissá történő átalakítása céljából az ecetsavas sóként keletkezett H-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly -NH, vegyületet kloroformban oldjuk, az oldatot hjgnátriirnbikarbonát oldattal mossuk, nátriumszulfát felett szárítjuk és be pároljuk. 3) Z-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH 4,05 g H-lle-Gln-Asn-OH vegyületet 70 ml vizben és 1,5 ml trietUaminban oldunk, majd 200 ml dimetilformamidot adunk, hozzá. Ezután 8 g Z-Tyr(tBu)-p-nitrcfenilészterrel (Z-Tyr(tBu)-OH-ból és p-nitrofenolból diciklohexUkarbodiimiddel előállítva, op.: 88-89° metanol-víz elegyből) egyesítjük és 72 órn át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután vákuumban 40°-on kb. 20 ml-re pároljuk be, 100 ml 0,5n nátriumbikarbonátoldatot és 200 ml étert adunk hozzá, az éteres fázist elválasztjuk és a vizes fázist jéggel hűtjük. 2n sósavval megsavanyítva a kivált Z-Tyr(tBu)-Ile— Gln-Asn-OH vegyületet leszivatjuk és jeges vizzel mossuk. Tisztítás céljából mégegyszer dirneülformamidos oldatból éterrel kicsapjuk. 4) H-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH 1,2 g 3) pontban kapott tetrapeptid származékot 50 ml 90%-os ecetsavban oldunk és 0,5 g Pd-szén (10% Pd) katalizátor jelenlétében hidrogénezünk. A hidrogénezés befejeztével a katalizátort leszivatjuk, a szűrletet szárazra pároljuk, és a maradékot nagy vákuumban 40°-on szárítjuk. j; BOC- Cys(TRI)- Tyr(tBu)-Ik- Gln-Asn-OH A 4. pontban keletkezett terméket 35 ml dimetilformamidban és 0,5 ml trietUaminban szuszpendáh'uk és víz hozzáadásával oldatba visszük. Ezután 1,0 g BOC-Cys(TRI)-p-nitrofenilésztert adunk hozzá, és a reakcióelegyet 48 órán át 28°-on állni hagyjuk. Nagy vákuumban 35°-pn bepároljuk, a maradékot 100 ml jéghideg In sósavval egyesítjük és a nyers pentapeptidszármazékot leszivatjuk. Jeges
