161356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén anyag és élő vírusvakcína előállítására a Marek-féle baromfibetegség vírusából

tőzéssel szemben, akár a fertőző anyag befecskendezése, akár természetes fertőzés során bekövetkezett állatról-állatra való átterjedés ellen, igen jelentős védelmet nyújtanak. Ezek a -megfigyeléseink, amelyek szerint egy onkogen, azaz daganatkeltő vírus immunogén alakját sikerült előállítanunk, újak, és megalapozták azt a lehetőséget, hogy első ízben állíthassunk elő ilyen típusú vírus ellen hatékony vakcinát. A találmány értelmében olyan módon állítóttunk elő antigén anyagot, hogy a Marek-féle betegség patogén vírusát baromfisejtekben paszszáltuk, és ezt a passzálást mindaddig folytattuk, amíg a vírus patogenitása olyan mértékben csökkent, hogy alkalmassá vált élő vakcina termelésére. A találmány értelmében végzett passzálással előállított attenuált vírusnak védőhatásán kívül egyéb előnyös tulajdonságai is vannak. Például, az attenuált vírus igen állandónak bizonyult *" olyan tekintetben, hogy baromfiba történt beoltása után nem változik vissza patogén vírussá. Továbbá, nemcsak azzal a patogén vírustörzzsel végzett ráfertőzés ellen nyújt védelmet, amelyből eredt, hanem a vírus más törzseivel szemben 2

* is, beleértve a különösen heveny törzseket. Azonkívül az attenuált vírus kevés hajlamosságot mutat arra, hogy egy baromficsoporton belül átterjedjen az oltott egyedekről az oltatlanokra, ami attenuált élővírusos vakcina gyakor- 30 lati alkalmazásakor különösen nagy előny. Az attenuált vírusból készült vakcinák további előnye, hogy lényegesen csökkentik a baromfi egyéb betegségeinek, különösképpen a kokcidiózisnak az előfordulását- Feltételezzük, hogy ez a 35 csökkenés a Marek-f éle betegség előfordulásának csökkenése révén ., bekövetkező általános egészségjavulásnak tulajdonítható. A találmány szerinti eljárás bármely Marekféle vírustörzsre alkalmazható. Különösen jó 40 eredményeket értünk el a HPRS 16; törzzsel, és minthogy ezt a törzset korábbi kutatásaink során alaposan megvizsgáltuk, a találmány megvalósítására különösen ajánljuk. A találmány megvalósításának a céljára azonban a vírusnak 45 más, a gyakorlatban előforduló és baromfiból kinyert törzsei is felhasználhatók. Ezek a más törzsek változó patogenitásúak, ami azonban tenyésztési és minden más jelentős tulajdonságukat illeti, lényegében megegyező típusúak, mint 50 ahogyan az az alábbi kísérletekből is kitűnik. Így a vírus két törzse, a Frant-törzsek, amelyeket egy specifikus kórokozóktól mentes tyúkállományból izoláltak, patogenitásuk tekintetében lényegesen különböznek, mégis attenuálásra ké- 55 pesek, hogy ezáltal a vírus védő alakját termeljék. A HPRS 16-tal rokon más törzsek például a HPRS 24 és a HPRS B14 törzs. Az Amerikai Egyesült Államokban rendelkezésre álló JM, GA, CAL—1 és CONN—A jelzésű törzsek a je- 60 len találmány alapján szintén attenuálhatók. Különösen a JM törzs hasonlóan szaporodik, és hasonló citopatogén hatást fejt ki, mint a HPRS és a Frant-törzsek, és ugyanazokat az A, B és C antigéneket tartalmazza. Mint ahogy már 65 : 4 előbb említettük, a vírus nehezen izolálható a sejtekből anélkül, hogy bizonyos változásokon ne esnék át, és ezért helyesebb sejthez kötött vírust használni inokulumként és az egyik paszszázsból a másikba történő átoltásra. Az attenuálási folyamat megvalósítására több baromfifaj sejtjei használhatók, mint plédául csirke, kacsa, fürj, fácán és pulyka sejtek; a csirke-sejtek különösen alkalmasak. Sejt- és szövettenyésztés céljára a vesesejtek vagy embrió-fibroblasztok különösen alkalmasaknak bizonyultak gazdasejtekként. Például daganatokból vagy más csirkeszövetekből izolált patogén vírus ismételten passzálható csirkevese szövettenyészetekben, amíg a kívánt attenuálás bekövetkezik. Ez rendszerint a 20—30. passzázs között kezdődik, és gyakran észlelhetjük például a 31. vagy 39. passzázs után, hogy a vírus olyan tulajdonságokat szerzett, hogy élő attenuált vakcina termelésére alkalmas. Annak érdekében, hogy maximális hatékonyságú vakcinát nyerjünk, tanácsos a passzálásra olyan sejteket használni, amelyek eredetileg vírusmentesek voltak. Igen kedvező eredményeket értünk el azáltal, hogy az attenuálást az egyik sejtféleségen való passzálással kezdtük el, és más típusú baromfisejteken végzett passzálással fejeztük be. Például csirkeembrió-fibroblaszt sejtek használata különösen előnyösnek bizonyult, és az attenuálás végrehajtásában igen előnyösnek találtuk, ha a vírust először csirkevese- vagy más baromfivese-tenyészeteken passzáltuk, majd a passzálást csirkeembrió-fibroblasztokon folytattuk. Eddig kidolgozott módszereink közül egyik leghatékonyabbnak bizonyult az, amelyben csirkeembrió-fibroblasztokat használtunk az attenuálási folyamat legtöbb passzázsához. Ilyen módon a patogén vírust 1—6, előnyösen 3 vagy 4 csirkevesesejt-passzázson vezetjük át, hogy a sejtrendszerhez hozzászoktassuk, és ezt követően 15—20 alkalommal csirkeembrió-fibroblasztokban passzáljuk. Két sejttípus használata lehetővé teszi, hogy a végtermék tisztaságát jobban ellenőrizhessük, és ebben a vonatkozásban a csirkeembrió-fibroblaszt sejteknek a Marek-féle betegség vírusára kifejtett nagyfokú szelektáló hatása különösen nagy jelentőségű. A csirkefibroblasztok amellett a tömegtermelésre különösen alkalmas sejttípust képviselnek. A megfelelő attenuálási fok eléréséhez szükséges passzázsok számát kísérleti úton általában könnyen meghatározhatjuk. A jól ismert géldiffúziós próba (Ouchterlony-technika) felhasználásával [Chubb és Churchill, Vet. Rec. 83, 4 (1963)] a tenyészeteket minden fokozatban megvizsgálhatjuk A-antigén jelenlétére. Figyelembe kell venni, hogy a szükséges passzázsok száma bizonyos mértékben a kiválasztott törzs eredeti patogenitásától függ. Rendszerint nem szükséges 30 vagy egyes esetekben 40 passzázsnál többet végezni, és gyakran, főként az előbb említett kétfokozatú módszer igénybevételével, elegendőnek bizonyulhat jóval kevesebb passzázs használata. A vírus baromfisejtekben való tenyésztése 2