161356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén anyag és élő vírusvakcína előállítására a Marek-féle baromfibetegség vírusából

5 161356 igen változatos táptalajokban végezhető, és több standard táptalajjal és módosításaikkal sikerült nagyon kielégítő eredményeket elérnünk. Például az Earl-féle pufferolt sóoldatj/laktalbumin hidrolizátumot (1. táptalaj, lásd az 1. példát) előnyösen használtuk. Különösen csirkeembriófibrobiasztok elsődleges tenyésztésekor jó eredményeket értünk el a 2. táptalajjal, amely 84% SM 199 oldatból, 5% (30 g/liter) triptóz-foszfát levesből, 5% borjúszérumból és penieillin/sztreptomicinből (mint az 1. táptalajban) állt. Az SM 199 oldat összetételét Morgan és munkatársai közlik [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1 (1950)]. Használható a 2. táptalaj egy változata is (3. táptalaj), amelyben az SM 199-et megemelt vitamin- és aminosavtartalHiú Eagle-féle oldattal [Macpherson és munkatársai: Virology, 16 147 (1962)] helyettesíthetjük. Használható a 2. táptalaj egy további módosítása is (4. táptalaj), amelyben az Earl-féle sókat a Hanks-félével helyettesítjük. (Összetételüket illetően lásd pl. J. Paul: „Cell and Tissue Culture", 4. kiad., E & S. Livingston, London 1970.) Figyelembe kell venni, hogy a találmány szerinti eljárás a Marek-féle betegség vírusának egy antigén, de nem patogén alakjában levő antigén anyag termeléséhez vezet, nevezetesen egy A-antigénmentes protektiv vírustörzshöz. Közelebbről, az antigénanyag olyan baromfisejtekből áll, amelyek sejthez kötött attenuált vírust tartalmaznak. Ez az anyag oltó törzsanyagként használható vakcina termelésére, és természetszerűen beletartozik a jelen találmány oltalmi körébe. Ilyen anyag sajátos fajtáját alkotják a HPRS 16 vírus attenuált változatát tartalmazó csirkesejtek. Csirkesejteknek attenuált vírust tartalmazó tenyészetét letétbe helyeztük a Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey állatorvosi vírusgyűjteményébe, ahol azt LEU/ 16/AT jelzéssel vették nyilvántartásba. Vakcina termelése céljából a fent leírt módon előállított attenuált vírust az attenuálásra használattal megegyező vagy ahhoz hasonló sejtrendszerekben tenyészthetjük tovább. Kívánság szerint az eljárás későbbi szakában a vírust egyik sejtrendszerről másik rendszerre vihetjük át. Például a vírus attenuálását és szaporítását tenyésztett sejtekben végezhetjük, majd a vírust egészséges csirkék véráramába olthatjuk, és az állatok vérének a felfogásával termelhetünk vakcinát. A jelen találmánynak megfelelően készült vakcinákat különféle módokon alkalmazhatjuk, például fiatal csirkének vagy embriónak bőr alá, izomba, orrba vagy szembe fecskendezve. A comb izomzatába történő befecskendezés a vakcina alkalmazásának különösen előnyös módszere. A találmányt a következő példákon szemléltetjük-1. példa A sejttenyészet készítése 1—8 hetes csirkék veséit kimúlásuk után azonnal kivágtuk, ollóval feldaraboltuk, 3 ízben 20 ml 7,2 pH-jú foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (PBS) rázás közben mostuk, majd dekantáltuk. A sejteket tripszinezéssel diszpergáltuk olyan módon, hogy Erlenmeyer-lombikban 20 ml PBS-ben oldott 0,05%-os tripszint (Difco 1:250 tripszin) adtunk a feldarabolt veseszövethéz. Mágneses keverő segítségével kevertük a tripszinoldatban szuszpendált vesevagdalékot, miközben a tripszinoldatot 4—5 percenként cseréltük. Az egyes tripszinezési ciklusokból nyert sejtszuszpenziót 1,0 ml borjúszérumhoz adtuk, hogy a tripszinhatást megakadályozzuk, és ezt követően a sejteket MSE Minor centrifugában percenként 1000 fordulattal 5 percig centrifugáltuk. A sejtüledéket sejttenyésztő tápfolyadékban (1. táptalaj) újra szuszpendáltuk, és a sejteket vérsejtszámláló kamrában megszámláltuk. A sejtszuszpenziót tenyésztő folyadékkal úgy hígítottuk, hogy 5,0 ml-ben 2xl06 sejtet tartalmazott. 1. tápfolyadék Earl-féle pufferolt sóoldat 84% triptóz-foszfát leves (30 g/liter) 5% laktalbumin hidrolizátum (50 g/liter) 5% borjúszérum, melegen inaktivált 5% penicillin (20,000 E/ml) 1 / sztreptomicin (20 mg/ml) J *'° Minden tenyészedénybe (50 mm átmérőjű műanyag Petri-csésze) 2xl06

sejtet adtunk 5,0 ml tápfolyadékban. A sejttenyészeteket 37—38,5 C°on inkubáltuk 5% széndioxidot tartalmazó nedvesített légkörben. Amikor az egyréteges tenyészetek összefolytak, rendszerint 3 napi inkubálás után, a tápfolyadékot fenntartó folyadékra cseréltük ki. Ez utóbbi összetétele ugyanaz volt, mint a tenyésztőfolyadéké, azzal a különbséggel, hogy a triptóz-foszfát leves és a borjúszérum arányát az egész térfogat 2—2%-ára csökkentettük. Az egyrétegű tenyészeteket a fenntartó folyadék hozzáadása után azon a napon fertőztük, amikor azok összefolytak. Vírusizolálás fertőzött csirkékből Erre a célra a heveny Marek-féle betegség HPRS—16 törzsének 25. csirkepasszázsát találtuk alkalmasnak. A petefészkek limfoid daganatait kézierővel steril spatulával Petri-csésze felett átdörzsöltük 5x5 cm nagyságú rozsdamentes acélszitán (lyukméret 978 sz.). Az átdörzsölt szövetet pipettázással PBS-ben szuszpendáltuk. Miután a szuszpenziót a nagyobb darabok leülepítésére üvegedényben 2 percig állni hagytuk, a felülúszó sejtszuszpenziót különválasztottuk, és percenként 1000 fordulattal 10 percig MSE Minor centrifugában ülepítettük. A sejtüledéket ezután kellő mennyiségű sejttenyésztő tápfolyadékban újraszuszpendáltuk. A keletkezett szuszpenziót mikroszűrős fecskendőben 150 sz- lyukméretű rozsdamentes szitán átszűrtük. A szűrlet nagyobbrészt egyedülálló daganatsejteket tartalmazott. Ezeket a sejteket vérsejtszámlálóval megszámoltuk, és a sejtkoncentrációt 10x106/1,0 ml sejtszámra állítottuk be. Minden 3 napos öszszefolyó egyrétegű csirkevese-szövettenyészetet 0,5 ml szuszpenzióval oltottuk be. Ebben az el-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3