161282. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trigliceridek enzimatikus, kvantitatív meghatározására

161282 egészen a szabad glicerinig jut el. Igen nagy mennyiségű enzimmel és igen hosszú inkubálási idővel, ami eddig a tökéletes bomláshoz szükséges volt, kvantitatív meghatározás gyakorlati okokból nem valósítható meg. 3. Az egyszerű, proteinmentes triglicerideket sok, a testtől „idegen" növényekből és fungicid anyagokból nyert lipázzal bontják el. A lipoproteidek bontása, illetőleg a fehérjéhez kötött zsíroké, ha egyáltalában megy, esak tökéletlen lehet, vagy pedig nagy mennyiségű enzim kell hozzá (több, mint 5 mg mintegy 2 ml oldatban) ami az optikai kimutatást a reagensek okozta zavarosodás miatt nem teszi lehetővé. Meglepő módon azt találtuk, hogy a Comptes Rendus Acad. Se. Paris, 259 (1964) 4394—4396. oldalán leírt Rhisopus arrhizus lipáz képes arra, hogy a lipoproteinhez kötött triglicerideket a chylomikronokban levő trigliceridek mellett is, rendkívül nagy hatásfokkal, kvantitatíven szabad zsírsavakká és glicerinné hasítsa, anélkül, hogy ez az ezután következő optikai NADH-meghatározást ibolyántúli fényben befolyásolná. Ez az eredmény annál is meglepőbb, mivel eddig a lipoproteinhez kötött trigliceridekkel szemben megfelelő aktivitással rendelkező „test idegen" lipáz még nem volt ismeretes, még kevésbé gondoltak arra, hogy hasonló anyagok kvantitatív meghatározására adagolják. Csak a találmány szerint eljárva vált lehetővé, hogy a proteinmentes semleges zsírok és protein-kötésű triglicerideket anélkül határozhassák meg, hogy előzetesen alkalikus hevítéssel elszappanosítsák, és az, hogy a próba feldolgozása teljesen enzimatikus legyen, a pontosság csökkenése nélkül. Azonkívül, hogy elkerülhetők a kellemetlenül kézbentartható, erősen maró alkáliák, a találmány szerinti eljárás mindenekelőtt jelentős időnyereséggel jár. Az enzimatikus zsírelszappanosítás ezenkívül azzal az előnnyel jár, hogy a szérumszükséglet a szokásos módszerrel szemben a térfogat 1/20-ára csökkenthető. Ennek mindenekelőtt a kis laboratóriumi állatokon, pl. fehér egereken és patkányokon végzett sorozat kísérletnél van jelentősége. Végül csak most vált lehetővé, hogy a proteinhez kötött trigliceridek meghatározását pl. ember szérumban vagy kapillar plazmában, előre preparált teszt-kombinációval — amely a szükséges enzimet és segédanyagot optimális mennyiségben és adott esetben puff er olt és stabilizált oldatban tartalmazza, — gyorsan és az eddigiek felhasználása nélkül lehessen elvégezni. Az előre elkészített teszt-kombinációkat előnyösen stabilizáló segédanyagokkal készítjük azért, hogy az érzékeny enzimkeverék hosszabb tárolása is megengedhető legyen, és hogy a laboratóriumi vagy orvosi gyakorlatban használható, stabilis kereskedelmi terméket kapjunk. Különösen előnyösnek bizonyult egy olyan teszt-kombináció, amely meghatározott térfogatban pufferolt, előreadagolt adenozin-trifoszfátot tartalmaz vizes oldatban, amely tris-hidroximetil-iamino-metán vagy alkáli-azidok adagolásával van stabilizálva és ettől különálló 5 porkeverék, előnyösen tabletták alakjában, 'amelyben az NADH és a f oszf oenolpyrovát-nátrium van előre adagolt mennyiségben. A porkeverék vagy a tabletták a leírt alakban nem tárolhatók, stabilizátorként semleges aminosa-10 vakat, pl. glicerint és előnyösen erős savak alkálisóját, pl. káliumkloridot adagolunk. A teszt reakció elvégzésekor a porkeveréket vagy a tablettákat a fent leírt adenozin-trifoszfát oldathoz adjuk. A tri-, di- vagy monoglice-15 rid tartalmú próbával egyesítjük, majd megkezdjük az előreakciót egy enzimkeverékkel, amely laktátdehidrogenázt, pyruvátkinázt és glicerokinázt tartalmaz. Az előreakció lefutása után leolvassuk az első extinkciós értéket és a 20 főreakciót a találmány szerint Rhizopus arrhizus lipázzal elvégeztetjük. Az első extinkciós érték és a mintegy 5 perccel később leolvasható második extinkciós érték különbsége közvetlenül utal a szabaddá vált glicerinre. Mivel ennél 25 az eljárásnál csak egyetlen pipetta lépés, nevezetesen a próba hozzáadása szükséges, a találmány szerinti teszt-kombináció további egyszerűsítést tesz lehetővé, és növeli a mono-, di- és tri-gliceridek kvantitatív meghatározásának 30 találati biztonságát. A találmány szerinti igen nagy tisztaságú Rhizopus arrhizus (Var. Delemar) lipáz az optimális 3,5 és 7,0 közötti pH értéknél olívaolajjal szemben 3500—8000 U/mg közötti aktivitással 35 rendelkezik. A Rhizopus-lipáz tisztaságát elektroforetikusan vizsgáljuk. A lipoproteinhez kötött tri-, di- és monogliceridek kvantatitív enzimatikus bontását adott esetben proteinmentes semleges zsírokkal együtt a találmány szerint az jellemzi, hogy a bontást a Rhizopus arrhizusból nyert lipáz enzimmel végezzük. A lipoproteinen között trigliceridek és/vagy oldatokban különösen testfolyadékokban levő proteinmentes semleges zsírok meghatározására szolgáló teljesen enzimatikus és kvantitatív találmányunk szerinti eljárást az jellemzi, hogy a lipoproteideket és a semleges zsírokat Rhizo-50 pus arrhizusból nyert lipázzal bontjuk meg, és a bomlás termékeként kapott glicerint önmagában ismert módon enzimatikusan határozzuk meg. A lipoproteidek és/vagy testfolyadékokban le-55 vő proteinmentes semleges zsírok teljesen enzimatikus meghatározására alkalmas teszt-kombináció hatóanyagként 1. foszfoenolpyruvátot, 2. adenozin-trifoszfátot, 60 3. lipázt, 4. laktátdehidrogenázt, 5. pyruvátkinázt, 6. glicerokinázt és 7. redukált alakban levő nikotinamidade-65 nin-dinucleotidet 40 45