161282. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trigliceridek enzimatikus, kvantitatív meghatározására
161282 tartalmaz, az jellemzi, hogy a teszt-kombinációban levő lipázt Rhizopus arrhizus kultúrából tenyésztettük ki. 1. példa 10 al emberi szérumot egymásután a következő reagensekkel egyesítünk: 1,5 ml trietanolamin-puffer (0,1 mólos) 7,8 pH-ra beállítva és NADH-t (0,12 m mólt) és magnéziumszulfátot (0,74 m mólt) tartalmazva 0,1 ml foszfoenolpyruvát-Na (4,8 m mól) és adenozin-trifoszfát (1,3 m mól) oldva 7,6 pH-ra állított trietanolamin-pufferban (0,1 mólos) 0,02 ml Rhizopus arrhizus-ból kapott lipáz (4mg/ml, 3500 E/mg = 14 000 E/ml) 0,005 ml laktátdehidrogenáz (900 E/ml) pyruvátkinázt 150 E/ml) Az így kapott oldatot 5 perc után küvettába töltjük és 366 nm-en az extinkciót meghatározzuk. (Ei). 0,005 ml glicerokináz (85 E/ml) adagolása után az enzim reakció lejátszódik, pyruváton át NADH-leadás közben NAD-hez vezet. További, 10 perc után leolvassuk a második extinkciós értéket. (E2). Az extinkció különbsége E=Ei—E2 a következő egyenlet szerint adja a triglicerid tartalmat: A E X 4224 = mg % triglicerid A. B. 15 25 30 Alkoholos kálilúggal Rhizopus arrhizusból elszappanosítás után nyert lipázzal bontva a zsírt 350 305 492 445 1063 1020 126 149 160 154 400 372 129 132 72 74 268 250 72 74 177 167 375 355 167 149 65 57 154 145 189 189 232 215 63 65 165 159 110 116 365 362 214 198 462 456 90 89 438 410 194 188 70 72 2. példa Az 1. példában megadott eljárás után 37 egyedi meghatározást végeztünk emberi szérummal és egyszer a hagyományos eljárással (a zsír elszappanosítása alkoholos kálilúggal), majd a találmány szerint a Rhizopus arrhizusból nyert enzimmel. Az eredményekből egy r=0,998 értékű koefficiens adódott. Az egyes eredményeket az I. táblázat ismerteti. í. táblázat Emberi szérumpróbák triglicerid tartalma mg °/o-ban. 3. példa A. Alkoholos kálilúggal elszappanosítás után B. Rhizopus arrhizusból nyert lipázzal bontva a zsírt 417 160 445 472 135 608 1798 1843 108 124 416 145 430 460 110 621 1925 1710 105 133 35 40 2,5 ml vizes pufferoldatot, amely 65 mg trietanolamin-hidrokloridot, 25 mg trisz-hidroximetil-aminometánt, 1,25 mg adenozin-trifoszfát-dinátrium sót, 1,25 mg magnéziumszulfátot (MgS04 . 7H2 0) tartalmaz, olyan tablettával elegyítünk, amely 4,5 mg NADH-t 45 6,0 mg foszfoenol-pyruvát-nátriumot, 58,8 mg glicint 14,8 mg káliumkloridot és 4,4 mg poliviaszt tartalmaz. A tabletta oldódása után az így előkészített 50 munkaoldatot küvettába töltjük, és 20 l( al szérummal, valamint mintegy 30 jú enzimkeverékkel elegyítjük, amelyben laktátdehidrogenáz, pyruvátkináz és glicerokináz van. Az előreakció lezajlása után meghatá-55 rozzuk az extinkciót, az elegyet 20 u uX Rhizopus arrhizusból nyert lipázzal elegyítjük és a triglicerid tartalmat az 1. példában megadottak szerint számítjuk ki a második extinkciós értékből. 60 Szabadalmi igénypont Eljárás lipoproteinhez kötött és/vagy proteinmentes zsírsavval oldatban levő trigliceridek 65 teljesen enzimatikus, kvantitatív meghatároza•A
