161252. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csökkent allergén hatású penicillinek előállítására

161252 3 4 mékben, és okai lehetnek az ilyen penicillinek alkalmazása során tapasztalt allergen reakcióknak (G. T. Stewart, Amer. Heart J. 1968, 429). Ezeknek a szennyezéseknek az eltávolítására a 6-aminopenicillánsavat vagy az abból készült penicillineket külön tisztító műveleteknek kell alávetni, például dialízist vagy gélszűrést (771 622 számú kanadai szabadalmi leírás) kell alkalmazni. Eközben a 6-APS vagy a penicillin jelentős része elvész, ami kitűnik abból, hogy benzilpenicillinből csak 12%-ot (1 078 847 számú brit szabadalmi leírás) és fenoximetilpenicillinből 56%-ot (1114 311 számú brit szabadalmi leírás) sikerült nyerni. Mindezek a nehézségek elkerülhetők, ha a jelen találmány értelmében sejtmentes vagy tisztított enzimkészítményt használunk. Ily módon, a találmány értelmében sejtmentes vagy tisztított enzimkészítményt alkalmazva penicillinek 6-helyzetében levő amidkötés felhasítására, jó hatásfokkal és lényegében fehérje jellegű szennyezésektől mentesen állítható elő 6-APS. Az ily módon kapott 6-APS acilezve jó hatásfokkal és további tisztítás nélkül szolgáltat a találmány értelmében csökkent allergen hatású penicillineket. Az irodalom beszámol számos kísérletről tisztított enzimkészítmények E. coli törzsekből történő előállítására. Borkar és munkatársai [Hindustan Antibiotics Bull. 4, 48, 152 (1961)] foszfátpufferoldatban szuszpendált sejteket ultrahanghullámokkal kezeltek, és így sikerült frakcionált kicsapással és oszlopkromatográfiai úton 25-szörös tisztítást elérniök. Holt és Stewart [Nature 202, 824 (1964)] tisztított enzimkészítményt állított elő szűrt fermentlé liofilizálásával és dializálásával. Szentirmai [Acta Microb. Acad. Soi. Hung. 12, 395 (1966)] ,az E. coli enzim 40-szeres koncentrálását érte el ammóniumszulfátos kicsapással, kalciumfoszfátgélen való adszorpcióval és DEAE cellulózon végzett kromatografálással ultrahanggal kezelt E. coli sejtek foszfátpufferos kivonatából. Sakaguchinak és Maraonak (26 050/64 számú japán szabadalmi leírás) sikerült E. coliból mérsékelt hozammal tisztított enzimkészítményt nyernie oly módon, hogy a sejteket huzamos ideig borátpufferral extrahálták, vagy ezt a kezelést rövidebb ideig ultrahanghullámos kezeléssel kombinálták. A kivonatból ammóniumszulfátos kicsapással, dialízissel és liofilizálással szilárd alakban nyerték ki az enzimet. Johnson és Hardcastle (3 297 546 számú amerikai szabadalmi leírás) enzimoldatot kaptak E. coliból oly módon, hogy a sejttenyészetet egy kétértékű fém sójával, rendszerint kalciumnitráttal, és egy kvaterner ammóniumvegyülettel kezelték, a sejteket szűréssel elkülönítették, majd néhány óra hosszat vízben szuszpendálták, a sejteket szűréssel eltávolították, és a szüredéket aktívszénnel kezelték. Ismeretes továbbá, hogy a baktériumsejtekben levő enzimek kiszabadíthatok a sejtszuszpenzióknak szűk nyíláson nagy nyomással való kisajtolásával. Duerre és Ribi [Appl. Microbiol. 11, 467 (1964)] az E. coliban található más enzimeket tanulmányozva azt találták, hogy az enzimek teljes felszabadítására 1000 att-nál nagyobb nyomásra van szükség. Ilyen nyomás alatt azonban a sejtfalak is felaprózódnak, és a sejtanyag jelentős része szolubilizálódik. Frazer [Nature 267, 33 (1951)] azt találta, hogy E. coli sejtek elroncsolhatók kis méretekben, ha 35—63 att gáznyomás alatt kisajtolják a sejteket egy acélpalackból. Mi azt találtuk, hogy az E. coli sejtekben levő penicillinaciláz üzemi méretekben extrahálható a mikroorganizmusból vízbe, ha a sejteket vagy azok vízzel vagy víz és szerves oldószerek elegy ével készült szuszpenzióját hirtelen felszabadítjuk legalább 35 att nyomás alól, amely azonban nem éri el a sejtek számbajövj roncsolódásához szükséges nyomást. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárás első lépése, penicillinaciláz előállítására E. coliból, magába foglalja az egy ilyen enzimet termelő E. coli törzs ismert módon való tenyésztését, a fermentlé eltávolítását és a sejtanyag gyors kisaj tolását egy keskeny résen legalább 35 att nyomás alkalmazásával, amgly azonban nem éri el azt a nyomást, amelyen a sejtek számbajövő mértékben roncsolódnak. 210 att nyomás alatt a sejtek még nem roncsolódnak számbajövően. Ezután a kezelt anyagot vízben elkeverjük, adott esetben szerves oldó^ szer és/vagy egy bázis, például nátriumhidroxid vagy trietilamin hozzáadásával, az enzim feloldása céljából. A találmány szerinti eljárás első lépésének egyik megvalósítási alakjában a fermentlé eltávolítását és a sejtanyag kisajtolását egyidejűleg végezzük egy öntisztító centrifugális szeparátorban (hámozó centrifugában) 0 és 50 C°, előnyösen 15 és 40 C° között, az elválasztott sejtanyagot szakaszosan 0,05—1,0, előnyösen 0,1—0,5 sec alatt kisajtolva egy 0,1—1,5, előnyösen 0,3—0,7 mm széles perifériális résen 34— 136, előnyösen 63—77 kg/cm2

nyomás alatt. Ha kívánatos, a férmentlét vízben kevéssé oldható szerves oldószerrel, például butilacetáttal, izobutilacetáttal vagy amilacetáttal telítjük a mikroorganizmus elölésére és a szeparátorban végbemenő folyamat elősegítésére. Hasonlóképpen lehetséges a sejtanyagnak vízzel való mosása a szeparátorban. A kisajtolt sejtanyagot 10—50, előnyösen 20—40 C°-on, 0,10—5,0, előnyösen 0,25—3,0, optimálisan 0,25—1,0 óra hosszat hatásos keverővel keverjük az enzim feloldására, és adott esetben közben hozzáadunk 1,0—5,0% vízzel nem elegyedő szerves oldószert, például metilizobutilketont, butilacetátot, izobutilacetátot, amilacetátot, benzolt, toluolt vagy kloroformot. Az enzimnek a kisajtolt sejtanyagból való extrahálódása megkönnyíthető egy szervetlen bázis, például nátriumhidroxid, káliumhidroxid vagy ammónia, vagy egy tercier szerves bázis, például trietilamin vagy N-etilpiperidin hozzáadásával és így a keverék pH értékelő 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9.