161252. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csökkent allergén hatású penicillinek előállítására

5 161252 6 nek 6,5 és 9,0, előnyösen 7,0 és 8,5 közé való beállításával. Az így kapott enzimoldat, esetleg vízzel való hígítás után, ismert módon, például szűréssel vagy centrifugálással vagy e két művelet összekapcsolásával, és esetleg színtelenítő, derítő és szűrést elősegítő anyagok, például aktívszén, alumíniumoxid, cellulózpor, kovaföld vagy más gyengén adszorbeáló anyagok hozzáadásával megszabadítható az esetleg visszamaradt sejtanyagtól és más szilárd szennyezésektől. Előnyös módszer a sejtanyag zömének eltávolítása centrifugálással, és a kapott folyadék szűrése. Az enzim tovább tisztítható a vizes oldat 3,0—6,0, előnyösen 4,0—5,0 pH értékre való megsavanyításával, a csapadék kiszűrésével és az eredeti pH érték helyreállításával. A penicillinaciláz az így kapott sejtmentes és adott esetben részben tisztított vizes oldatokból fehérjékkel mérsékelten oldható komplexeket alkotó anyagokkal, például csersavakkal kiválasztható. A találmány szerinti eljárás egyik változata szerint az enzimoldatot 4—6, előnyösen 4,5—5,5 pH-nál 300—900 mg/kg végső koncentrációig vasionokkal komplexet alkotó kelátképző vegyületek, például etiléndiamintetraecetsav jelenlétében csersavval kezeljük. A képződött enzim-csersavkomplex szokásos módon, például szűréssel vagy centrifugálással elkülöníthető. Ezután kívánság esetén mossuk, szárítjuk; a vizet, például szárítással, nevezetesen liofilizálással, vagy vízzel elegyedő szerves oldószerekkel, például acetonnal történő kezeléssel eltávolítjuk. A csersavas komplex alkalmas az enzim tárolására és szárítására. Felhasználható közvetlenül is penicillinek, például benzilpenicillin oldalláncának eltávolítására. A csersavas csapadék penicillinaciláz-tartalma felszabadítható vizes oldatban a komplexnek 7—9, előnyösen 7,5—8,5 pH-nál vízben való oldásával. Ügy is eljárhatunk, hogy a komplexet víznek és vízzel nem elegyedő oldószernek, például n-butanolnak a keverékével 4—7, előnyösen 4,5—5,5 pH-nál kezeljük. A csersav eltávolításának további módja abban áll, hogy a vízben szuszpendált enzim-cser savkomplexet anioncserélővel, például DEAE-cellulózzal kezeljük. Ez megköti a csersavat, és az enzim a vízbe kerül. Az ezekhez a műveletekhez szükséges víz mennyisége sokkal kisebb, mint az eredeti enzimoldatok víztartalma, úgyhogy i;~-~ inúdon az enzim hatásosságának lényeges fokozódása érhető el. A találmány szerinti eljárás keretében a kapott oldatok penicillinaciláz-tartalma ioncserélővel növelhető és tisztítható. Eszerint az enzimet 3,5—6,0, előnyösen 4,0—5,0 pH értékre beállított oldatának SE-Sephadex, karboximetilcellulóz vagy CM-Sephadex kationos ioncserélővel töltött oszlopon való átbocsátásával adszorbeáltatjuk, vagy az ioncserélőt keverés közben az enzimoldathoz adjuk. Az aciláz az ioncserélőről felszabadítható egy 6,0—8,0 pH értékű puff er oldattal, például 0,2 mólos ammóniumacetáttal vagy trisz-hidroximetilammóniumacetáttal való eluálással. Tisztább enzimkészítmények előállítására a szervetlen ionok és kis molekulasúlyú szennye-5 zések az enzimoldatokból vízzel szemben való dializálással távolíthatók el. Ugyanez érhető el az oldatoknak szükség esetén 50 C° alatti hőmérsékleten 25—100 mg/ml koncentrációig való bepárlása után végzett gélszűréssel. 10 Az előzőkben ismertetett műveletek bármelyikével kapott vizes oldatok igen alkalmasak közvetlenül természetes penicillinek oldalláncainak, különösen pedig benzilpenicillin oldallg láncának eltávolítására. Az ismertetett műveletekkel kapott enzim kinyerhető a vizes oldatból szilárd állapotban liofilizálással, porlasztásos szárítással, vákuumban való bepárlással vagy kicsapással, ismert mód-20 szerek szerint. Az elkülönített szilárd enzimnek nagy a fajlagos aktivitása, és nagyon alkalmas tárolásra és szállításra. Az ilyen szilárd, vízben oldható enzimkészítményeknek számos technikai előnyük is van, mert lehetővé teszik, hogy 25 töményebb oldatokkal dolgozzunk, mint amelyeket a sejtszuszpenziókat alkalmazó ismert eljárásokban használnak. Az enzim elkülönítésének előnyös módja az 30 enzimoldat liofilizálása —10 és 50, előnyösen 0 és 30 C° között vagy lebegtetéses szárítás levegőáramban 10—55, előnyösen 35—45 C°-on. A találmány szerinti eljárással készült tisztított enzimek és enzimoldatok nagyon alkalmasak és előnyösek a találmány következő lépésének, 6-aminopenicillánsav előállításának végrehajtására penicillinek, különösen benzilpenicillin oldalláncának eltávolításával. A termékek 40 hozama és tisztasága lényegesen nagyobb, mint ami eddig ismert eljárásokkal, E. coli sejtek szuszpenziójának alkalmazásával, elérhető volt. Azt találtuk továbbá, hogy az így készült 6--aminopenicillánsav nagyon kevés olyan aller-4g gén hatású fehérje jellegű szennyezést tartalmaz, amely az E. coli sejtek szuszpenziójával készült 6-APS készítményeket szennyezi. Ennek nagy a műszaki jelentősége, ment a találmány révén lehetővé válik csökkent allergen 50 hatású penicillinek előállítása a fentiek szerint készült 6-APS-ből közvetlenül, további tisztító műveletek nélkül. A találmány -rtelmében ily módon előállítható csökkent allergen hatású penicillinek, például az a-fenoxietilpenicillin, 55 a-fenoxipropilpenicillm, 2,6-dimetoxifemlpenicillin, 3-(o-klórfen£)-5-metil-4-izoxazolilpenicillin, a-karbonilbenzilpenícíllin, ct^azidobenzilpenicillin és ct-aminobenzilpenicillin. A következő példákban szemléltetjük a talál-60 mány szerinti eljárás egyes lépéseit, nevezetesen a sejtmentes enzimtermék előállítását és tisztítását, 6^aminopenicillánsav előállítását természetes penicillinekből (például benzilpenicillinből) és végül a szintetikus penicillinek előál-65 lítását 6-aminopenicillánsavból. 3