161251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejtmentes penicillinaciláz előállítására

19 161251 20 Az eredményekből kitűnik, hogy a szokványos módszerekkel készült 6—APS készítmény* különbözik a többi 6—APS készítménytől a paszszív bőrérzékenységi reakciót kiváltó képesség tekintetében. Ez kifejezi a találmány szerinti eljárással készült 6—APS csökkent antigén hatását a szokványos eljárásokkal, teljes E. coli sejtekkel készült 6—APS-sel összehasonlítva. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás vizes oldatban vagy szilárd alakban levő sejtmentes penicillinaciláznak és polimerrel módosított származékainak előállítására penicillinacilázt termelő Escherichia coli baktérium tenyésztésével kapott sejtanyagból a zzal jellemezve, hogy a sejtanyagot adott esetben a sejtek elölése után egy centrifugális szeparátorban 0 és 50 C° közötti hőmérsékleten 35 att-nál nagyobb, de a sejtek szétroncsolásához szükségesnél kisebb nyomással egy keskeny résen vagy nyíláson kiszorítjuk, az így kezelt, intracelluláris enzimet tartalmazó sejtanyagot vízben 10 és 50 C° közötti hőmérsékleten 0,1— 5,0 óra hosszat keverve az enzimet extraháljuk, majd adott esetben az így kapott vizes penicillinaciláz oldatot 3,0—6,0 pH-ra megsavanyítva, a kivált inaktív anyagot szűréssel, a kis molekulasúlyú oldott szennyezéseket adott esetben dialízissel vagy koncentrálás utáni gélszűréssel eltávolítva és a szüredék eredeti pH-ját visszaállítva megtisztítjuk, majd a) adott esetben a sejtmentes penicillinacilázt az oldatból szilárd alakban kinyerjük, vagy b) a vizes penicillinaciláz oldatból a penicillinacilázt vasíonokkal komplexet alkotó kelátképző vegyületek jelenlétében 4—6 pH-nál csersavval kiválasztjuk, majd az így kapott enzimcsersav komplex csapadékot elkülönítjük, és a komplexből a penicillinacilázt bj) az elkülönített komplexnek vízben 7—9 pH-nál val'ó oldásával, b2) az elkülönített komplexnek víz és n-butanol elegyben 4—7 pH-nál való oldásával vagy bs) a vízben szuszpendált elkülönített komplexből a csersavnak dietilaminetilcellulózzal való megkötésével felszabadítjuk, és/vagy c) a vizes penicillinaciláz oldatot 3,5—6 pH-ra beállítjuk, és átbocsátjuk egy nyílt szerkezetű kationkicserélő oszlopán, vagy a kationkicserélc't hozzáadjuk keverés közben az enzim oldatához, majd az enzimet az ionkicserélőnek gyenge pufferoldattal, előnyösen 0,2 mólos ammóniumacetát vagy trisz-hidroximetil-ammónium-acetát oldattal 6,0-^-8,0 pH-nál való eluálásával koncentráljuk és tisztítjuk, végül kívánság esetén a sejtmentes penicillinacilázt az oldatból szilárd alakban kinyerjük, és/vagy a tisztított sejtmentes penicillinacilázt aktívált polimerrel reagáltatva kémiailag módosítjuk. (Elsőbbsége: 1969. február 13.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja sejtmentes penicillinaciláznak vizes oldatban vagy szilárd alakban való előállítására penicillinacilázt termelő Escherichia coli baktérium tenyésztésével kapott sejtanyagból azzal j ellemezve, hogy a sejtanyagot adott eset-5 ben a sejtek elölése után egy centrifugális szeparátorban 0 és 50 C° közötti hőmérsékleten 35 att-nál, nagyobb, de a sejtek szétroncsolásához szükségesnél kisebb nyomással egy keskeny résen vagy nyíláson iszorítjuk, az így kezelt, 10 intracelluláris enzimet tartalmazó sejtanyagot vízben 10 és 50 C° közötti hőmérsékleten 0,1— 5,0 óra hosszat keverve az enzimet extraháljuk, majd adott esetben az így kapott vizes penicillinaciláz oldatot 3,0—6,0 pH-ra megsavanyítva,. 15 a kivált inaktív anyagot szűréssel, a kis molekulasúlyú oldott szennyezéseket adott esetben dialízissel vagy koncentrálás utáni gélszűréssel eltávolítva és a szüredék eredeti pH-ját visszaállítva megtisztítjuk, majd adott esetben a sejt-20 mentes penicillinacilázt az oldatból szilárd alakban kinyerjük. (Elsőbbsége: 1968. február 15.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatom sítási módja vizes oldatban vagy szilárd alakban levő sejtmentes penicillinaciláznak és polimerrel módosított származékainak előállítására azzal jellemezve, hogy a centrifugális szeparátorban nyomás alatt kezelt intercelluláris enzimet tartalmazó sejtanyagból extrahált és adott esetben tisztított 30 a) vizes penicillinaciláz oldatból a penicillinacilázt vasionokkal komplexet alkotó kelátképző vegyületek jelenlétében 4—6 pH-nál csersavval kiválasztjuk, majd az így kapott enzimcsersav komplex csapadékot elkülönítjük, és a komplexből a penicillinacilázt ai) az elkülönített komplexnek vízben 7—9 píl-nál való oldásával, 82) az elkülönített komplexnek víz és n-butanol elegyben 4—7 pH-nál való oldásával vagy a3) a vízben szuszpendált elkülönített komplexből a csersavnak dietilaminetilcellulózzal való megkötésével felszabadítjuk, és/vagy b) a vizes penicillinaciláz oldatot 3,5—6 pH-ra beállítjuk, és átbocsátjuk egy nyílt szerkezetű kationkicserélő oszlopán, vagy a kationkicserélőt hozzáadjuk keverés közben az enzim oldatához, majd az enzimet az ionkicserélőnek gyenge pufferoldattal, előnyösen 0,2 mólos ammóniumacetát vagy trisz-hidroximetil-ammónium-acetát oldattal 6,0—8,0 pH-nál való eluálásával koncentráljuk és tisztítjuk, végül kívánság esetén a sejtmentes penicillinacilázt az oldatból szilárd alakban kinyerjük, és/vagy a tisztított sejtmentes penicillinacilázt aktivált polimerrel reagáltatva kémiailag módosítjuk. (Elsőbbsége: 1968. december 3.) 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás ío-60 ganatosítási módja azzal jellemezve, hogy 35—140 att nyomást alkalmazunk, (Elsőbbsége: 1968. február 15.) 5. Az 1., 2. és 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja azzal j e í-65 1 e m e z v e, hogy a sejtanyagot 0,1—1,5 mm 10