161251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejtmentes penicillinaciláz előállítására
161251 17 mot szűrőn elválasztottuk, a kristályokat 50 ml metilizobutilketonnal mostuk, és 50 C°-on vákuumban megszárítva 16,5 g terméket kaptunk. A termék 96% tisztaságú volt, és az összes hozam benzinpenicillinre számítva 75%. 18 Analóg módon, az előző példák szerint készült • más enzimkészítményeket használva készítettünk 6-(D-a-azido-fenilacetamidp)-penicillánsavas nátriumot. A 2. táblázatban közöljük a hozamokat és a penicillin tisztaságát. 2. táblázat Benzilpenicillin K-só, g Enzim 6-(D-a-azido-fenilacetamido)-penicillánsav Példa Benzilpenicillin K-só, g példa gramm E/g hozam g tisztaság % hozam, % 16b 21 3 6,3 1600 18,9 95,8 81 ' 16c 21 4a 4,2 2920 18,0 94,0 76 16d 21 5 5,4 2340 16,2 89,7 65 16e 21 7a 145 87. 20,4 95,8 87 16f 21 7b 6 1890 • 19,7 96,6 86 16g 21 7c 0,1 128000 18,5 96,0 79 16h 21 9b 5,4 2400 20,5 92,7 85 16i 21 10 2,4 6000 18,5 95,5 79 16j 21 9a 0,9 14000 20,0 91,4 82 35 17. példa Benzilpenicillin enzimes szintézise 25 175 mg 6-aminopenicillánsavat és 111 mg fenilecetsavat feloldottunk 10 ml káliumfoszfátpufferoldatban 7,0 pH-nál. A 7c példa szerint előállított 128 000 E/g aktivitású acilázból 3,6 30 mg-ot feloldottunk 5 ml vízben, és az oldatot hozzáadtuk az előbbi oldathoz. Az oldat pH-ját 1 mólos foszfor savval 5,0-ra állítottuk be, és 37 C°-on inkubáltuk. A pH-t 5,0 értéken tartottuk, és 4 óra elmúltával az oldatot lehűíöttük, és papírkromatográfiai úton megelemeztük. A 6-aminopenicillánsav 30%-a átalakult benzilpenicillinné. 40 18. példa Antigén-hatás próbák Módszer: passzív bőrérzékenység vizsgálata tengeri malacokon Weck és munkatársai módszerével [Int. Arch. Allergy'33, 535—567 (1968)]. Házinyúl-eredetű 6-aminopenicillánsav-antiszérumot készítettünk nyers 6—APS ismételt szubkután befecskendezésével és dializált 6— APS ugyanilyen módon való kétszeri befecskendezésével. Passzív hemagglutinációs próbákban ennek az antiszérumnak a titere 1/4096 volt. Ebből a 6—APS antiszérumból 1 ml-t intravénásán befecskendeztünk egy fehér tengerimalacba. 24 óra elmúltával intravénásán befecskendeztünk 0,1 ml 5%-os fiziológiás sóoldatos Evans-kék oldatot, majd egy óra elmúltával intradermálisan beadtunk 0,1 ml oldatot, amely 4 mg, a 14d, 14g, illetve 14i példák szerint készült 6-aminopenicillánsavat tartalmazott. Az anat hátának egy negyedik pontjára a szokásos módon E. coli teljes sejtjeinek felhasználásával készült 6—APS injekciót adunk. A 6—APS injekciókat közvetlenül feloldódás után alkalmaztuk. Kontroliképpen 0,1 ml fiziológiás sóoldatot 65 fecskendeztünk be intradermálisan. Egy második tengerimalaccal megismételtük ugyanezt a kezelést, azzal a különbséggel, hogy a 6—APS antiszérumot intravénásán befecskendezett 1 ml fiziológiás sóoldattal helyettesítettük. Az intradermális injekciók után 2 órával meghatároztuk az injekciós helyek kék színeződését, és kifejeztük egymásra merőleges két átmérő szorzataként. 45 50 Eredmények: A 6—APS injekciók mind a nem érzékenyített, mind a passzívan érzékenyített állatban a színezék szétterülését okozták, és ez nagyobb mértékű volt, mint a fiziológiás sóoldat befecskendezésének helyén. Azonban, mint a 3. táblázatból kitűnik, a szokványos 6—APS injekció erősebb reakciót váltott ki az érzékenyített állatban. Ugyanezt teszi, bár sokkal kisebb mértékben a találmány szerinti eljárással kapott 6—APS. 3. táblázat 4 mg intradermálisan befecskendezett 6—APS okozta kék foltok 2 egymásra merőlegesen mért átmérőjének (mm2 ) szorzatai. 6-APS 55 készítmény Példa sorszáma 60 Érzékenyített állat Nem érzékenyített állat Különbség E. coli sejtekkel készült készítmény 256 110 146 14d 132 12Q 22 14g 195 169 26 14i 156 169 —13 Fiziológiás sóoldat 12 12 — 9
