161251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejtmentes penicillinaciláz előállítására

161251 A találmány szerinti eljárással kapott tisztított . enzimkészítmények alkalmas kiindulási anyagok az enzim kémiai 'módosítására aktivitás és/vagy technológia tekintetében előnyösebb tulajdonságú termékek előállítása céljából. Így például az enzimet aktivált polimer anyagokkal, például ciánbromiddal kezelt poliszacharidokkal reagáltatva olyan termékekhez juthatunk, amelyekben az enzim polimerhez van kötve. Az ilyen termékek megtartják az enzim hatásosságát, és előnyösen használhatók penicillinek felhasítására, mert visszanyerhetők a reakcióoldatból egyszerű módon, például szűréssel. A polimer enzimkészítmény oszlopokban is felhasználható 6—APS folytonos üzemű előállítására penicillinek oldatának az oszlopon való átbocsátásával. A következő példákban szemléltetjük a sejtmentes enzimtermék előállítását és tisztítását, 6-aminopenicillánsav előállítását természetes penicillinekből (például benzilpenicillinből) és szintetikus penicillinek előállítását 6-aminopenicillánsavból. 1. példa Escherichia coli baktériumsejtek előállítása 3 kg kukoricalekyárt, 135 ml szójababolajat, 12 ml paraffinolajat és 3 ml etanolt elkevertünk 150 ml vízben, és a keveréket 165 ml 45 %-os nátriumhidroxid oldattal beállítottuk 6,0 pH-ra, majd fermentorban 124 C°-on 30 percig sterilizáltuk. Az oldatot beoltottuk 100 ml 20— 24 órás E. coli Astra 1339 tenyészettel, és levegőztetés és keverés közben 25 C°-on 18 óráig inkubáltuk. 300 kg kukoricalekvárt, 13,8 kg szójababolajat, 1,22 kg paraffinolajat, 0,3 kg cetanolt, 21 kg fenilecetsavat és 112 kg nátriumkloridot elkevertünk 14 000 liter vízben, és a keverék pH-ját 40 kg 45%-os nátriumhidroxid oldattal beállítottuk 6,6 értékre, majd fermentorban 124 C°-on 30 percig sterilizáltuk. Az oldatot lehűtése után beoltottuk a fentiek szerint készült tenyészettel, majd keverés és levegőztetés közben 25 C°-on inkubáltuk. A beoltás után 24 órával, amikor a pH 8,2 értékre nőtt, a baktériumsejtek életműködését 180 liter butilacetát hozzáadásával megszüntettük, és a keveréket lehűtöttük. 2. példa Penicillinaciláz elkülönítése és tisztítása a) A baktériumtömeg elkülönítésére a keveréket egy öntisztító centrifugális szeparátorban (De Laval, BRPX 213—35S típus) 27 C-on a sejtanyagnak 0,5 mm széles nyíláson 70 att nyomáson való gyors kiszorításával elválasztottuk. A baktériumsejt pépet 100—120 kg-os adagokra osztottuk. Mindegyik adaghoz hozzáadtunk 3,0% metilizóbutilketont, majd a keveréket egy Ultra Túrral keverővel (T 110/2M 15 20 típus) 25 percig homogenizáltuk. A kapott baktériumtömeg összesen 325 kg volt. Az enzimet előállítása különböző lépéseiben megelemezve a következő adatokat kaptuk aci-5 láz egységekben kifejezve az illető lépés során visszamaradó enzim mennyiségére (egy aciláz egység megfelel annak az enzimmennyiségnek, amely 1,5 óra alatt 8,5 pH-nál és 37 C°-e*n 1 mg 6-aminopenicillánsavval egyenértékű ben-10 zilpenicillint képes hasítani): termelő fermentációs tenyészet 5 E/ml folyadékfázis 0,33 E/ml a centrifugális szeparátorból távozó , folyadék 0,28 E/ml baktériumsejt-pép 212 E/g a pép feletti folyadék, homogenizálás előtt 75 E/g a pép feletti folyadék, homogenizálás után 123 E/g b) A 2a példában kapott baktériumsejt-pépet használtuk fel enzimszolubilizálási kísérletre. 100 g sejtpéphez 100 ml ionmentesített vizet adtunk. 25 Az így kapott szuszpenzió pH-ja 5,9 volt; ezzel a következő kísérletsorozatot végeztük: 1. A szuszpenziót 5000 G-vel (centrifugális erő a gravitáció többszörösében mérve) centrifugáltuk 20 percig, és meghatároztuk a folya-30 dékfázis enzimatikus aktivitását. 2. A szuszpenziót Ultra Turrax keverővel 5 percig homogenizáltuk. A kezelés közben a mintát jégfürdőben hűtöttük, nehogy a hőmérséklete 35 C° fölé emelkedjék. Ezután az előző 35 1. pontban leírt módon centrifugáltuk, és a folyadékfázis aktivitását meghatároztuk. 3. A szuszpenzió pH-ját nátronluggal keverés közben 8,5-re állítottuk be, majd a mintát homogenizáltuk és centrifugáltuk a fent leírt mó-40 don, és meghatároztuk a folyadékfázis aktivitását. 4. A szuszpenzióhoz 3% metilizóbutilketont adtunk, és a pH-ját a 3. pontban leírt módon beállítottuk. Ezután a mintát homogenizáltuk 45 és centrifugáltuk a fent leírt módon, és meghatároztuk a folyadékfázis enzimatikus aktivitását. A szolubilizálási műveletet a következő táblázat szemlélteti: 50 E/g Az egész %-a Baktérium szuszpenzió 106 100 1. folyadékfázis 29 28 2. folyadékfázis 62 59 3. folyadékfázis 73 69 55 ,4. folyadékfázis 83 78 c) 175 kg 190 E/g aktivitású homogenizált baktériumpépet 175 kg vízzel hígítottunk, és a keverékhez keverés közben hozzáadtunk 22,7 kg Hyflö-t, 22,7 'kg Celite 505-öt és 10,2 kg 60 Fibraflo-t/ A vizes fázist Funda szűrőn át való szűréssel elkülönítettük, és a szűrőlepényt 50 1 vízzel mostuk. A, 290 kg egyesített oldat aktivitása 48 E/g volt. d) Egy kg 212 E/g aktivitású homogenizált 65 baktériumpépet 2,0 liter vízzel hígítottunk, és a 4