161251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejtmentes penicillinaciláz előállítására

9 161251 10 keverék pH-ját 220 ml 0,5 n nátriumhidroxiddal 8,5 értékre állítottuk be, majd 20 C°-on 30 percig kevertük. Ezután a keveréket 13 200 G-vel 30 percig 0 C°-on centrifugáltuk (Serwall, RC—2 típus, automatikus hűtött szupercentrifuga). A folyadékfázist dekantáltuk, és szűréssel derítve 2,7 kg oldatot kaptunk 50 E/g aktivitással. Az üledéket 1 liter vízben 2 ízben 8,5 pH-nál 5 percig szuszpendálva, majd centrifugálva 2 kg további enzimoldatot kaptunk 11 E/g aktivitással. Ez megfelel összesen 74% vízben oldható aciláz aktivitás hozamnak. e) A 2d példa szerint kapott 2 kg 50 E/g aktivitású víztiszta acilázoldatot liofilizálva 98,5 g szilárd acilázt kaptunk 950 E/g aktivitással. _ f) A 2d példa szerint kapott 2 kg 50 E/ml aktivitású víztiszta acilázoldatot porlasztva szárítva 92 g szilárd acilázt kaptunk 920 E/g aktivitással. g) A 2d példa szerint kapott 1 kg 52 E/ml aktivitású víztiszta acilázoldatot folyó csapvízzel szemben 8 óra hosszat dializáltunk. A dializáit oldatot liofilizálva 20,5 g szilárd acilázt kaptunk 2400 E/g aktivitással. h) A 2c példa szerint kapott 245 kg 48 E/g aktivitású tiszta acilázoldatot keverés közben 2,2 kg 9 n ecetsavval beállítottunk 4,5 pH-ra. A keverést 1 óra hosszat folytattuk, majd a keveréket leszűrtük, és az oldatot keverés közben 4,5 kg 7 n ammóniával 8,0 pH-ra állítottuk be. Egy óra múlva a keveréket leszűrtük, és az oldatot 2,0 kg 9 n ecetsavval 5 pH-ra állítottuk be. A kapott 220 kg oldat aktivitása 47,5 E/g volt. i) A 2d példában kapott 500 g 52 E/g aktivitású folyadékfázist a fehérje jellegű szennyezések lecsapására beállítottuk 4 pH-ra, és 15 percig 0 C°-on kevertük. Centrifúgálás és 7,5 pH-ra való beállítás után a kapott 500 g víztiszta 40 E/g aktivitású oldatot éjjelen át csapvízzel szemben dializáltuk, majd liofilizálva 4 g 4900 E/g aktivitású termékét kaptunk. j) Egy kg 128 E/g aktivitású homogenizált baktériumpépet 30 percig 0 C°-on 13 200 G-vel centrifugáltunk (Serwall, RC—2 típus, automatikus hűtött szupercentrifuga). Az 500 g 80 E/g aktivitású folyadékfázist dekantáltuk, szűréssel derítettük, és közvetlenül felhasználtuk 6-aminopenicillánsavnak penicillin enzimes hasításával való előállítására. 3. példa Cs.ersa.vas aciláz előállítása 185 kg 47,5 E/g aktivitású, a 2h példa szerint készült pH-frakcionált 'acilázoldatot 50 g etiléndiamintetraecetsavval kevertünk, majd hozzáadtuk 108 g csersavnak és 55 g nátriumszulfitnak 5,5 liter vízzel készült oldatát. Égy órai keverés után 1,5 kg Celite 505-öt és 700 g nát• riumszulfitot adtunk hozzá, és a szuszpenziót leszűrve 3950 g nedves szilárd csersav-aciláz terméket kaptunk 1930 E/g aktivitással. 4. példa Aciláz kinyerése a csersavas csapadékból a) A 3. példa szerint készült 30,4 g 1930 E/g aktivitású nedves csersav-aciláz csapadékot 30 ml —10 30 C°-os acetonnal kezeltünk, az acetont lassan keverés közben hozzáadva. A csapadék részleges feloldódása után azonnal további 200 ml hideg acetont adtunk hozzá, és a keveréket leszűrtük. A szilárd maradékot hideg acetonban mostuk, és levegőn szobahőmérsékleten éjjelen át szárítottuk. Hozam 15,4 g, aktivitás 3650 E/g. b) A 3. példa szerint készült, 3750 g 1930 E/g aktivitású nedves csersav-aciláz csapadékot 5,0 liter 0,1 mólos, 5,0 pH értékű vizes ammóniumacetát-oldat és 2,5 g butanol keverékében szuszpendáltunk. Hozzáadtunk 50 g nátriumszulfitot, és ecetsavval 5,0 pH-ra állítottuk be. A keverést 20 percig folytattuk, és a keveréket leszűrtük. A 6650 ml térfogatú 800 E/ml aktivitású vizes fázist elválasztottuk. c) A 2h példában leírt módon pH-frakcionált 1000 ml 48 E/ml aktivitású acilázoldatot a 3. példa szerint csersavval kezeltünk. A csersavaciláz csapadékot szűrőn elválasztottuk, és keverés közben 100 ml 0,1 mólos, 8,0 pH értékű cmmóniumacetátpufferban szuszpendáltuk. A keverést 1 óra hosszat folytattuk, és a pH-t 8,0-ra állítottuk be. A keveréket leszűrve 100 ml acilázoldatot kaptunk 220 E/ml aktivitással. d) A 4c példa szerint 8 pH értékű pufferoldatban szuszpendált csersav-aciláz csapadékot 2 g 1,0 milliekvivalens/g kapacitású DEAE-cellulózzal kezeltünk. A keveréket 15 percig kevertük, és leszűrve 90 ml 494 E/ml aktivitású acilázoldatot kaptunk. e) A 3. példa szerint kapott 36,6 g 1250 E/g aktivitású csapadékot 150 ml 8 pH értékű 0,2 mólos ammóniumacetát pufferban szuszpendáltunk. 10 perc keverés után hozzáadtunk 60 ml butanolt, majd 9 mólos ecetsavval beállítottuk 5,0 pH-ra. A keverést 10 percig folytattuk, majd a keveréket leszűrtük. A vizes fázist (166 ml, aktivitása 140 E/ml) elválasztottuk. 5. példa A csersavas acilázcsapadék liofilízálása A 3. példában leírt módon kapott 86,1 g 1600 E/g aktivitású nedves csersav-aciláz csapadékot —30 C°-ra hűtöttük, és vákuumban 25 C°on 0,1—0,2 torr nyomás alatt megszárítottuk. 28,5 g száraz terméket kaptunk 2340 E/g aktivitással. 6. példa Az enzim szárítása a) Porlasztásos szárítás A 2h példa szerint kapott 5 litnr 47,5 E/ml aktivitású víztiszta acilázoldatot 1 óra alatt porlasztva szárítottunk, amikor a taléyő levegő 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5