161214. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pregnán- és androsztán sorbeli 3 béta -hidroxi-5,6-epoxiszteroidok mikrobiológiai átalakítására
161214 3 4 oldószerrel extraháljuk a fermentléből, és az 1. példa extraktumból például bepárlás és ismert tisztítási módszerek, például átkristályosítás és/vagy 6ß-13a-äihidroxi-3-oxo-13,17-szeko-e-andkromatográfia alkalmazása útján elkülönítjük. rosztén-17-sav-lakton 5 A találmány a pregnán- vagy androsztán-sorbeli 6-hidroxi-3-keto-zf*-szteroidok műszaki szempontból egyszerű előállítását teszi lehetővé. Ezek a vegyületek a hormonhatású szteroidok, például a farmakológiai szempontból értékes 11/?-hidroxiszteroidok előállításának fontos közbeeső termékei, másrészt azonban gyógyszer-hatóanyagként önmagukban is felhasználhatók. A reakció sima lefutása és a végterméknek az eljárás műszaki alkalmazhatóságát biztosító hozama a szakember számára váratlan volt. S. S. Lee és Ch. J. Sih közleményéből [Biochem. 3, 1267(1964)] ugyanis az olvasható ki, hogy 3/?-hidroxi-5a,6a-epoxi-androsztán-17-on gombákkal, például Nocardia restrictus fajjal történő fermentálása nem alkalmas 3-hidroxil-csoport bevitelére, mivel az előállítani kívánt 6ct-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion kis hozammal (maximum 15%) keletkezik, és gyűrűfelhasadás közben túlnyomórészt 9,10-szeko-szteroidok keletkeznek. A találmány szerinti eljáráshoz szükséges kiindulási vegyületeket, a 3/?-hidroxi-, ül. 3/?-acetoxi-5,6-epoxi-szteroidokat a megfelelő 3/?-hidroxi-, ill. 3/9-aciloxi-zl5-szteroidokból állítjuk elő oly módon, hogy a A5 kettős kötést önmagában ismert módon, például persavakkal epoxidgyűrűvé alakítjuk. A 3/?-hidroxi-21-acetoxi-16a-metil-5-pregnén-20-on esetében például az alábbi módon állítjuk elő a kiindulási szteroidvegyületet. 60 g 3/?-hidroxi-21-acetoxi-16ct-metil-5-pregnén-20-ont 1,8 liter metilénkloridban oldunk, és hozzáadunk 12 g megolvasztott nátriumacetátot és 40 g vízmentes nátriumszulfátot. 2 °C hőmérsékleten, keverés közben fél óra alatt 36 ml peroxiecetsavat, majd újabb 12 g nátriumacetát és 40 g nátriumszulfát hozzáadása után ugyancsak fél óra alatt további 36 ml peroxiecetsavat csepegtetünk a reakcióelegybe. A reakeióelegyet még két órán át keverjük, miközben az szobahőmérsékletre melegszik fel. Az elegyet 1 liter 5%-os NaHCC>3-oldattal összekeverve semlegesítjük, a metilénkloridos oldatot elválasztjuk, vízzel, FeS04 -oldattal, majd újra vízzel mossuk, Na2S0 4 on megszárítjuk és vákuumban 40 °C hőmérsékleten bepároljuk. A maradékot etilacetátból átkristályosítjuk. 3/?-hidroxi-21-acetoxi-5et,6a-epoxi-16a-metil-pregnán-20-ont kapunk mintegy 85%-os hozammal. Olvadáspontja: 167—169 °C. 7637 SCHE—256 1971. július A 3-acetátokat a megfelelő #-3-acetátokbói epoxidgyűrű-képzéssel vagy a 3/?-hidroxi-5a,6a-epoxidok utólagos acetilezésével állítjuk elő. 500 ml sterilizált vizes oldatot, amely 0,3% élesztőkivonatot, 0,5% kukoricalekvárt és 0,2% keményítőt tartalmaz, és amelynek pH-ját 7-re állítunk be, Flavobacterium dehydrogenans liofilizált kultúrájával oltunk be, és 48 órán át rázatjuk 30 °C hőmérsékleten 145 fordulattal percenként. 14,75 liter fenti összetételű sterilizált tápoldatot inokulálunk a baktériumszuszpenzió 250 ml-ével egy 20 literes fermentorban, és az elegyet 24 órán át rázatjuk 29 °C hőmérsékleten és 220 fordulattal percenként, miközben 1650 liter/óra sebességgel levegőztetünk. Az előfermentáció során így előállított fermentléből 0,9 litert átviszünk egy 20 literes fermentorba, amelybe előzőleg 15 liter fenti összetételű tápoldatot töltöttünk be. A főfermentációt ugyanolyan körülmények között hajtjuk végre, mint az előfermentációt, azonban a pH-t 6 és 7 közötti értéken tartjuk. 6 órás növekedési fázis után 3,75 g S/í.lSa-dihidroxi-ö/S^/S-epoxi-lS,!?-szeko-androsztán-17-sáv-lakton 80 ml dimetilformamiddal készített oldatát adjuk a fermentléhez. A reakció előrehaladását a fermentléből kivett minták metil-izobutil-ketonos extraktumának vékonyréteg-kromatográfiás elemzésével követjük. 28 óra múlva a kiindulási vegyület teljesen átalakul. A fermentlevet ekkor metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, és az extraktumot vákuumban, legfeljebb 40 °C fürdőhőmérsékleten szárazra pároljuk. A maradékot kevés hideg hexánnal mossuk, azután megszárítjuk. 3,2 g nyersterméket kapunk. Etilacetát-metanol és etilacetát-diizopropiléter elegyből átkristályosítva 2,1 g (58%) 6/?,13a-dihidroxi-3-oxo-13,17--szeko-4-androsztén-17-sav-laktont kapunk. Olvadáspontja: 222—224 °C. «234=10 200. 2. példa 6a,21 -dihidroxi-16a-m,etil-4-pregnén-3,20-dion 7,5 g hidroxi-21-acetoxi-5a,6a-epoxi-16ot-metil-pregnán-20-on 100 ml dimetilformamidos oldatát hozzáadjuk 15 liter Flavobacterium dehydrogenans baktériumkultúrához, és az 1. példában megadott körülmények között fermentáljuk, azzal a különbséggel, hogy főfermentációhoz 1% keményítőextraktumot és 0,77% KH2 P0 4 -ot tartalmazó tápoldatot használunk. A kiindulási vegyület 33 óra alatt átalakul. A szokásos feldolgozás után 3,2 g nyersterméket kapunk, amelyet etilacetátból átkristályosítunk. A termék olvadáspontja: 177/179—181 °C. £239=14 890. 3. példa 6a-13a-dihidroxi-3-oxo-13,l 7-szeko-4-androsztén-17-sav-lakton 3,75 g 3/?,13a-dihidroxi-5a,6a-epoxi-13,17-15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
