161213. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pregnán- vagy androsztán sorbeli 3 béta-hidroxi-5,6-epoxiszteroidok mikrobiológiai átalakítására
161213 3 tesen vagy aerob feltételek biztosításával tenyésztjük, tovább szaporítjuk, és oldat vagy szuszpenzió alakjában hozzáadjuk a szubsztrátumot. A fermentáció előrehaladását vékonyréteg-kromatográfiás elemzéssel követjük. A fer- 5 mentáció befejeződése után a terméket egy alkalmas szerves oldószerrel extraháljuk a fermentléből, és az extraktumból például bepárlás és ismert tisztítási módszerek, például átkristályosítás és/vagy kromatográfia alkalmazása út- 10 ján elkülönítjük. A találmány a pregnán- vagy androsztán-sorbeli 6-hidroxi-3-keto-zf1,4 -szteroidok műszaki szempontból egyszerű előállítását teszi lehetővé. Ezek a vegyületek hormonhatású I szteroidok 15 előállításának fontos közbenső termékei, másrészt azonban gyógyszer-hatóanyagként önmagukban is felhasználhatók. A reakció sima lefutása és a végterméknek az eljárás műszaki alkalmazhatóságát biztosító hozama a szakember számára vá- 20 ratlan volt S.S. Lee és Ch. J. Shi közleménye [Biochem. 3, 1267, (1964)] alapján ugyanis az lett volna várható, hogy 3/J-hidroxi-5,6-epoxi-csoportot tartalmazó szubsztrátumot a mikroorganizmusoK 9,10-szeko-szerkezettel rendelkező végter- 25 mékké alakítják. A találmány szerinti módon előállítható vegyületek részben már önmagukban rendelkeznek gyógyászati hatással. így pl. a 6,0-hidroxi-prednizolon gyulladásgátló hatást mutat (DAS 30 1.095 278). Továbbmenve, az eljárás termékei értékes közbenső termékek gyógyászatilag hatásos más vegyületek előállításához. Így pl. az előbbi vegyületből a 6-hidroxicsoportot lehasítjuk és a megfelelő 3-keto-J1,4' 6 -szteroidokat ál- 35 lítjuk elő, amelyek az 1 244 178 sz. NSZK-beli és a 3 234 093 számú USA-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárások szerint gyógyászatilag hatásos l,2a-metüén-zl4 ' 6 -szteroiddá (ilyen pl. az l,2a-metilén-17a-acetoxi-4,6-pregnadién-3,20- 40 -dión, gesztagén) vagy l,2a-metilén-6-halogénzf4 ' 6 -szteroiddá (ilyen pl. az ismert antiandrogén, a 6-klór-l,2a-metilén-17a-acetoxi-4,6--pregnadién-3,20-dion) alakíthatók át. 45 Különösen értékesek a pregnán-sorbeli 6/?,ll/?-dihidroxi-3-keto-zl1 ' 4 -szteroidok, amelyek a találmány szerinti eljárás segítségével egyszerű módon előállíthatók. Az így előállított szteroidok pl. a 6a-hidroxi-prednizolon 6-dehidro-ve- 50 gyületté alakíthatók, amelyek a A6 kettős kötés szelektív dehidrogénezése útján a megfelelő 11/?-hidroxi-S-keto-zl^-szteróiddá (pl. prednizolonná) alakíthatók. Másrészről a 6ct,ll/?-dihidroxi-3-keto-/l^-szteroidokat (pl. 6ct-hidroxi-predni- 55 zolont) adott esetben az oldallánc közbenső védelme után ketalizálás útján a megfelelő 3,6,11--triketo-zí^-szteroidokká oxidáljuk, amelyek a H. J. Friend [J- Amer, Chem. Soc, 81 (1959), 1235] és G. B. Spero [J- Amer. Chem. Soc, 79 60 (1957), 1515] által leírt eljárások analógiájára a megfelelő 6ofr-metil-szteroiddá alakíthatók (pl. 6a-metil-prednizolonná, vagy 9a-fluor-6a-metil-prednizolonná, amelyek közismerten nagyon hatásos vegyületek). 65 4 A találmány szerinti eljáráshoz szükséges kiindulási vegyületeket, a 3/?-hidroxi- ill. 3/J-acetoxi-5,6-epoxiszteroidokat a megfelelő 3/?-hidroxi-, ül. 3/?-aciloxi-zl5-szteroidokból állítjuk el& oly módon, hogy a A5 kettős kötést önmagában ismert módon, például persavakkal epoxidgyűrűvé alakítjuk. A 3/S-hidroxi-21-acetoxi-16a-metil-5-pregnén-20-on esetében például az alábbi módon állítjuk elő a kiindulási szteroidvegyületet. 60 g 3/?-hidroxi-21-acetoxi-16a-metil-5-pregnén-20-ont 1,8 liter metilénkloridban oldunk, és hozzáadunk 12 g megolvasztott nátriumacetátot és 40 g vízmentes nátriumszulfátot. 2 C C hőmérsékleten, keverés közben fél óra alatt 36 ml peroxiecetsavat, majd újabb 12 g nátriumacetát és 40 g nátriumszulfát hozzáadása után ugyancsak fél óra alatt további 36 ml peroxiecetsavat csepegtetünk a reakcióelegybe. A reakcióelegyet még két órán át keverjük, miközben az szobahőmérsékletre melegszik fel. Az elegyet 1 liter 5%-os NaHCCVoldattal összekeverve semlegesítjük, a metilénkloridos oldatot elválasztjuk,, vízzel, FeSC-4-oldattal, majd újra vízzel mossuk, Na2S04 -on megszárítjuk és vákuumban 40 °C hőmérsékleten bepároljuk. A maradékot etilacetátból átkristályosítjuk. 3/?-hidroxi-21-acetoxi. -5ct,6a-epoxi-16a-metil-pregnán-20-ont kapunk,. 85%-os hozammal. Olvadáspontja: 167—159 °C. A 3-acetátokat a megfelelő zf5 -3-acetátokbóI epoxidgyűrű-képzéssel vagy a 3/?-hidroxi-5a,6a-epoxidok utólagos acetüezésével állítjuk elő. 1. példa Erlenmeyer-lombikban elhelyezett 500 ml sterilizált vizes tápoldatot, amely 0,1% élesztőkivonatot, 0,5% keményítőcukrot tartalmaz, és amelynek pH-ját 7,0-re állítottuk be, Arthrobacter simplex liofilizált kultúrájával oltjuk be és 48 órán át rázzuk 30 CC hőmérsékleten 145 fordulattal percenként. A baktériumszuszpenzió 250 ml-ével 14,75 liter fenti összetételű sterilizált tápoldatot inokulálunk egy 20 literes fermentorban, és a folyadékot 24 órán át 29 °C hőmérsékleten keverjük 220 fordulattal percenként, miközben 1650 liter/óra sebességgel levegőztetünk. Az így végrehajtott előfermentáció után az elegyből 0,9 litert átviszünk egy 20 literes fermentorba, amelybe elzőleg 14,1 liter összetételű sterilizált tápoldatot töltöttünk be. A főfermentációt az előfermentációhoz hasonló körülmények között hajtjuk végre, és a pH-t 6 és 7 közötti értéken tartjuk. 6 órás növekedési fázis után 3,75 g 3/?,13a-dihidroxi-5a,-6a-epoxi-13,17-szeko-androsztán-17-sav-lakton 80 ml dimetil-formamiddal készített oldatát adjuk az elegyhez és a szteroidot fermentáljuk. A reakció előrehaladását a kultúrából kivett minták metil-izobutil-ketonos extraktumának vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatával követjük. Mintegy 34 óra múlva a kiindulási anyag teljesen átalakul. A fermentlevet metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, és az extraktumot legfeljebb 40 °C fürdőhőmérsékleten vákuumban szá-2
