161202. lajstromszámú szabadalom • Eljárás janiemicin antibiotikum előállítására

161202 5 1. példa Paradicsompép-zabliszt agaros lemezeket beoltunk Streptomyces macrosporeus ATCC 21988 törzzsel. Ezután 10-—14 napig inkubáljuk, majd felhasználjuk 125 ml-es Erlenmeyer-lombikokban levő 25 ml vizes szójabablisztes táptalaj beoltására. A táptalaj összetétele a következő: szójababliszt 15,0 g szárított őrölt burgonya 15,0 g glukóz 50,0 g kobaltklorid-dihidrát 0,005 g kalciumkarbonát 10,0 8 agar 2,5 g 10 15 desztillált vízzel kiegészítve 1000 ml-re. A táptalajt 30 percig 121 °C-on, 1 att nyomáson sterilizáljuk. Az Erlenmeyer-lombikokat 25°C-on 72—98 óra hosszat inkubáljuk 5 cm lökettel 280 20 percenkénti fordulattal működő rázógépen. A 125 ml-es Erlenmeyer-lombikokból 5 tf%-os adagokat átviszünk olyan 500 ml-es Erlenmeyerlombikokba, amelyek 100 ml-t tartalmaznak ugyanolyan táptalajból, de agar nélkül. Ezeket a 25 lombikokat beoltjuk, és a fentebb ismertetett módon rázatjuk. Mintát veszünk a 4. és 6. napon. Ezeket a micélium kicentrifugálása és a folyadékfázissal azonos térfogatú metanollal való extrahálása után megvizsgáljuk. A folyadékfázist 30 és a metanolos kivonatot papírkromatografálással és biológiai próbával vizsgáljuk. Kromatografálás céljára kellő mennyiségeket felviszünk Whatman 1 papírra, és a kromatogramokat kifejlesztjük 4:5:1 tf arányú n-butanol-víz-ecetsav ol- S5 dószerrendszerrel. Ennek az oldószerrendszernek a felső fázisát használjuk oldószerként. Ebben a rendszerben a janiemicin Rf értéke 0,13. Biológiailag az antibiotikumot Staphylococcus aureus 209P-vel mutathatjuk ki. 40 2. példa Egy 30 literes Streptomyces macrosporeus 45 ATCC 21388 tenyészetet fermentálunk 38 literes rozsdamentes acéledényben az alább leírt közegben és üzemi körülmények között. 1. lépés 50 Oltóanyag: tejen való liofilizálással eltartott és paradicsompép-zabliszt agar lemezen kitenyésztett Streptomyces macrosporeus ATCC 21388 tenyészet. A tenyészet felületéről vett telepet 11 ml 55 0,01% habzásgátló szert tartalmazó vízben szuszpendáljuk, és 3 ml ilyen szuszpenziót használunk fel oltóanyagként. A táptalaj összetétele: 60 szójababliszt 15,0 g szárított őrölt burgonya 15,0 g glukóz 50,0 g kobaltklorid-dihidrát 0,005 g «5 kalciumkarbonát 10,0 g agar 2,5 g desztillált vízzel feltöltve 1000 ml-re. Ebből a táptalajból 50 ml-t beoltás után egy 250 rnl-es Erlenmeyer-lombikban forgó rázógépen 25 °C-on 96 óra hosszat inkubálunk. A rázógép 5 cm lökettel percenként 280 fordulattal működik. 2. lépés Oltóanyag: 50 ml az 1. lépésből. Közeg ugyanaz, mint az 1. lépésben. 1000 ml táptalajt és oltóanyagot egy 4000 ml-es lombikban rázógépen 2ö°C-on 96 óra hosszat inkubálunk. A rázógép percenként 120 lökéssel működik. 3. lépés Oltóanyag: 2000 ml a 2. lépésből. Táptalaj: szójababliszt cerelóz kalciumkarbonát habzásgátló szer 30,0 g 20,0 g 10,0 g 0,5 g desztillált vízzel kiegészítve 1000 ml-re. 30 liter oltóanyagot tartalmazó táptalajt 144 óra hosszat inkubálunk. Inkubálás közben rázatjuk, és az első 12 órában percenként 0,3 m, majd percenként 1,2 m felületi levegősebességgel levegőztetjük. Az így készült 113 liter egyesített fermentléhez 5,6 kg szűrést elősegítő anyagot adunk, és az oldhatatlan anyagot szűréssel eltávolítva 26,6 kg micéliumlepényt kapunk. A micéliumlepényt 3 ízben 53—53 liter metanollal extraháljuk. Az extrahálások között a lepényt szűrőre visszük. Az egyesített metanolos kivonatokat a metanol eltávolítására vákuumban 5 literre koncentráljuk. Az így kapott vizes szuszpenziót 6 liter n-butanollal telített vízzel, majd 2 ízben 2 liter n-butanollal telített vízzel extraháljuk. A fermentlé 92 liternyi szüredékét tömény sósavval beállítjuk 7,0 pH-ra, és 3 ízben 30 liter n-butanollal telített vízzel extraháljuk. Az így kapott 75 liter butanolos fázist egyesítjük a micéliumlepény extrahálása során kapott 6 liter butanolos kivonattal. Az egyesített butanolos frakciókat vákuumban bepároljuk a butanol eltávolítására. Az így kapott 6 liter vizes szuszpenziót ismét extraháljuk 6 liter n-butanollal telített vízzel, majd 2 ízben 2 liter n-butanollal telített vízzel. A butanolos kivonatokat egyesítve 10 liter butanolos kivonatot kapunk. Ezt vákuumban kb. 2 literre koncentráljuk. Mintegy 40 liter acetont adunk a butanolos koncentrátumhoz, mire amorf csapadék jelenik meg. A csapadékot szűréssel vagy centrifugálással elválasztjuk, és vákuumban állandó, 9,7 g súlyig szárítjuk. "Az így kapott, acetonban oldhatatlan porból 5,55 g-ot [1900 hígítási egység mg-onként 3