161202. lajstromszámú szabadalom • Eljárás janiemicin antibiotikum előállítására

161202 8 (H.E./mg) Staphylococcus aureus 209P-vel végzett kétcsöves hígítási próba szerint] feloldottunk egyensúlyba hozott víz-n-butanol keverékben (100 ml mindegyik fázisból), és megtisztítottuk négycsöves ellenáramú megosztással, az alsó fázist mozgatva. Az anyagmennyiségek és aktivitások a fázisokban a következők voltak: Aktivitás Fázis Súly (S.aureus 209P) n-butanol, 1. cső 0,488 g 5100 H.E./mg n-butanol, 2. cső 0,500 g 4200 H.E./mg n-butanol, 3. cső 0,245 g 1100 H.E./mg n-butanol, 4. cső 0,231 g 220 H.E./mg víz, 1. cső 0,390 g 8 H.E./mg víz, 2. cső 0,738 g 8 H.E./mg víz, 3. cső 1,200 g 11 H.E./mg víz, 4. cső 1,190 g 4,982 g 4 H.E./mg összesen: 1,190 g 4,982 g 5 x 106

H.E. Az antibiotikum tehát az 1. és 2. cső n-butanolos fázisában van túlnyomó részben. Egy antibiotikumot tartalmazó oldat hígítási egysége (H.E.) megfelel annak a számértéknek, amely megadja, hogy az oldat legfeljebb hányszoros hígításban képes egy adott vizsgálati mikroorganizmus szaporodását standard körülmények között in vitro megakadályozni. A hígítási egység meghatározására egy antibiotikum-oldatot sorozatosan hígítunk, például ismételten kétszeresére, és egyes hígítások alikvot részét kémcsövekhez adjuk, amelyek a vizsgálati baktérium adott táptalajjal készült standardizált szuszpenzióját tartalmazzák. A vizsgálati baktérium szaporodására kedvező hőmérsékleten meghatározott ideig való inkubálás után a szaporodást a kémcsövekben, vagyis a turbiditást összehasonlítjuk egy baktériumot nem tartalmazó kémcső tartalmának turbiditásával. A baktérium növekedését még megakadályozó legnagyobb hígítás a vizsgált antibiotikum-oldat hígítási egysége. 3. példa A janiemicin részleges tisztítása kovasavgéles kromatografálással végezhető. Például 779 g, előzőleg a 2. példában leírt módon oldószeres megosztással részben megtisztított anyagot feloldottunk 2:3 arányú n-propanol-n-butanol elegyben, és felvittük ezzel az oldószerrendszerrel nedvesített 200 g kovásavgélből álló oszlopra. Az oszlopot eluálva 183 mg kis aktivitású anyagot kaptunk. Tovább eluálva 2:3:4 arányú n-propanol-n-butanol-n-ammónia rendszerrel további 80 mg kis aktivitású anyagot, majd 97 mg janiemicinben dús anyagot kaptunk. A kromatografálás menete könnyen követhető az eluátum 264 mattnál mutatkozó abszorpciója révén. 4. példa 76 mg janiemicinben dús anyagot a 3. példában leírt eljárással kapott termékből kromatografáltunk dimetilszulfoxidban 2,5 cm átmérőjű és 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 80 cm magas Sephadex—G—50 oszlopon. Az eluátumot 254 mju-nál ellenőriztük, és az aktív anyagot tartalmazó frakciókat (kb. 1,7 ml-t frakciónként) Petri-csészés próbával mutattuk ki. Az aktivitás zömét a 100—132. frakciókban találtuk, ami megfelel egy csúcsnak a 114. frakciónál a spektrumok alapján megrajzolt görbén. A 100—132. frakciókat egyesítettük, és vákuumban szárazra bepárolva 35 mg amorf szilárd anyagot kaptunk 5500 H.E./mg titerrel. 5. példa 1715 mg janiemicinben dús, a 4. példában leírt módon tisztított anyagot tovább tisztítottuk kovasavgélen végzett preparatív vékony réteges kromatografálással, 2:3:4 arányú n-propanol-n-butanol-n-ammónia rendszerrel eluálva. Az Rf 0,04—0,15 sávot elválasztottuk, és az antibiotikumot a kovasavgélből ugyanazzal az oldószerrendszerrel eluáltuk. Az oldószert eltávolítottuk, és a maradékot dimetilszulfoxidban oldottuk. Metanolt hozzáadva az antibiotikum kicsapódott. Megismételve a kicsapást, vákuumban való szárítás után 40 mg amorf terméket kaptunk. Az ily módon készült anyag titere 5000—6000 H.E./mg. összetétel: C 47,49, H 5,30, N 13,07% Ultraibolya színképe: Xmax

99%-os vizes dimetilszulfoxidban 239, 272 rna; Xmax

0,15 n ammóniában (8 pH) 253 m/*. Rf 0,13 (Whatman 1 szűrőpapír, 4:1:5 arányú n-butanol-ecetsav-víz rendszer); Rf 0,85 (Whatman 1 szűrőpapír, 4:3:7 arányú n-butanol-piridin-víz rendszer). A janiemicin infravörös színképét a csatolt ábra mutatja. 30%-os formamid jelenlétében 3,3 pH-nál végzett elektroforézis szerint a termék 3 antibiotikus összetevőből áll. Szafranin 0-t használva katodikus indikátorként és apaiont elektroozmotikus indikátorként az összetevők számított elektroforetikus mobilitási értékei +85, +44 és +12 voltak. 6. példa Kétszeres csőhígításos próbát végeztünk különféle mikroorganizmusokkal. Az ezekben a vizsgálatokban használt antibiotikum tisztasága megfelelt a 4. példában kapott anyag (100—132. frakciók) tisztaságának. Közepes gátló koncentráció (/.tg/ml) - 0,12 0,01 0,2 0,16 0,12 >100 >100 Mikroorganizmus Staphylococcus aureus 209P Streptococcus pyogenes C203 Bacillus subtilis ATCC 0633 Sarcina lutea ATCC 9341 Diplococcus pneumoniae, 3. típus, ATCC 6303 Escherichia coli ATCC 10536 Candida albicans CBS 35H Mycobacterium tuberculosis BCG SC 5516 Trichomonas vaginalis SC 8560 >25,0 >25,0 4