161173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok előállítására
161173 13 14 gén lúgos közegben, majd az így kapott, disszociált vegyületeket a fent ismertetett körülmények között tovább reagáltatjuk. A disszociációt általában fenol és víz 75:3 arányú elegyével váltjuk ki. A (VI) és (III) általános 5 képletű vegyületek elegyét alkálifémhidrogénkarbonáttal, pl. káliumhidrogénkarbonáttal pH = 8 értékre lúgosított vizes fenol-oldatba adagoljuk, majd az elegyhez fölös mennyiségű alkálifémhidrogénkarbonátot adunk, és az elegyet kb. 10 10 percig keverjük. Az így kapott terméket elkülönítés nélkül reagáltatjuk tovább a megfelelő, Z—CO—CH2— CO—R általános képletű ß-diketonnal. A kondenzációt a korábbiakban ismertetett körülmények között hajtjuk végre, a közben- 15 ső termék elkülönítése nélkül. A (VII) és (IA) általános képletű vegyületek alkálifémsóik formájában képződnek, azonban — tekintettel arra, hogy pH = 8 értéken a karboxil-csoportok sóképzése csak részben megy végbe — a vegyületek 20 alkálifémtartalma az elméleti mennyiségnél (molekulánként 6 alkálifématom) kevesebb. A pirimidin-gyűrűzárás teljessé tétele érdekében a vízben oldható, disszociált (VII) és (IA) általános képletű alkálifémsók elegyét gyengén lúgos, he- 25 terogén, vizes közegben, oldószer, pl. alkohol jelenlétében a megfelelő /3-diketonnal reagáltatjuk. Lúgos reagensként célszerűen hidrogénkarbonátvegyületet, pl. káliumhidrogénkarbonátot alkalmazunk. Ha reagensként acetilacetont használunk 30 fel, a pirimidin-gyűrűzárás 20—25 C°-on 4—5 nap alatt ér véget. A pirimidin-gyűrűzárás összes reakcióideje tehát pl. a következő lehet: 1. lépés: 15 nap + 2. lépés: 5 nap, vagy 1. lépés: 10 nap + 2. lépés: 10 nap. 35 A fenti eljárással (III) általános képletű alkálifémsókat kapunk erősen asszociált molekulaaggregátumok formájában. A (III) általános képletű vegyületeket a korábbiakban ismertetett módon alakítjuk az (I) általános képletű végtermé- 40 kéké. A reakció során kapott, vízben oldódó, disszociált (IA) általános képletű vegyületek kromatográfiás elemzéssel kimutatható szenynyezést nem tartalmaznak. A korábbiakban ismertetett szerkezeti képletek 45 szarvasmarha hasnyálmirigyéből elkülönített inzulinra vonatkoznak. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A példákban kiindulási anyag- 50 ként szarvasmarha hasnyálmirigyéből elkülönített inzulint alkalmaztunk, megjegyezzük azonban, hogy bármilyen eredetű (pl. disznó, birka, ló stb. hasnyálmirigyéből elkülönített) inzulinból is kiindulhatunk. A találmány oltalmi köre ez 55 utóbbi inzulinfajtákból kiinduló eljárásokra is kiterjed. 1. példa. (IA) általános képletű vegyület (R és Z egyaránt metil-csoportot jelent) káliumsójának előál- 60 lítása homogén reakcióközegben. A só vízben oldódik, és gyengén asszociált, vagy disszociált formában van jelen. A. lépés: (III) általános képletű vegyület (R és Z egya- 65 ránt metil-csoportot jelent) káliumsójának előállítása. A só vízben nem oldódó, erősen asszociált molekula-aggregátumokat képez. 480 ml 7%-os vizes káliumhidrogénkarbonátoldatban 12 g inzulint oldunk, és az oldathoz 300 ml acetilacetont és 360 ml 95%-os alkoholt adunk. Az elegyet közömbös gáz atmoszférában, fénytől védve 20 napon át 25 C°-on és 8,3 pH-értéken keverjük. A kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük, majd vízzel, acetonnal, végül éterrel mossuk. A csapadékot szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. 7,73 g színtelen, porszerű terméket kapunk, amely az R és Z helyén egyaránt metil-csoportot tartalmazó (III) általános képletű vegyület káliumsója. A vegyület erősen asszociált molekula-aggregátumokat képez, vízben, ecetsavban és híg sósavoldatban nem oldódik, 0,1 n vizes ammóniaoldatban részben oldható, és pH~12 értékű nátrium- vagy káliumhidroxid-oldatban oldódik. Különböző oldószer-rendszerekben, savas vagy lúgos közegben végzett papírkromatográfiás vizsgálatok alapján a termék mozgékonysága gyakorlatilag nulla. Cellulóz-szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok során a termék mozgékonysága gyakorlatilag nullának adódik. A termék dichroikus abszorpciója is az erősen asszociált szerkezetet támasztja alá. A cirkuláris dichroizmus-görbén 303 m^-nál pozitív maximum jelenik meg, és a görbe nem tartalmaz negatív maximumot 222 m^-nál. Cirkuláris dichroizmus (0,15 M vizes nátriumklorid-oldat és 0,1 n vizes nátriumhidroxid-oldat elegyében; az elegy klorid-ion koncentrációja 0,003 n): A E 1% x 103 7o 1 cm' 303 millimikronnál = + 15,9 216 millimikronnál = —435 210 millimikronnál = —466 195 millimikronnál = +394 Összetétel: C27 4H39 3 0 7 8N 65 S 6 K 6 = 6282,531 Szulfáthamu: 5,9—6,2% (elméleti érték 6 K-ra: 8,35%) Oldószertartalom 100 C°-on, vákuumban: 4,9% Szabad guanidin-tartalom: < 6,7% (kolorimetriás elemzés a Sakaguchi-reakció segítségével) A termék sósavas hidrolizátumának (a hidrolízist 6 n sósavoldattal, 100 C°-on, 24 órán át végeztük) kétdimenziós papír kromatogr am ján vagy vékonyrétegkromatogramján arginin nem jelenik meg (elméleti mennyiség: <5%), és kimutatható az Nő-ornitin B22 nitrogénatomjához kapcsolódó dimetil-4,6-pirimidinil-2-csoport hidrolíziséből származó hidroxi-2-dimetil-4,6-pirimidin. Savval felszabadítható acetilaceton: 3,8% (=2,24 mól/möl). (A meghatározás előtt a terméket zárt csőben, 100 C°-on, 20 percig 2 n sósavoldattal hidrolizáltuk, majd az acetilaceton mennyiségét ortofeniléndiamin jelenlétében, 500 nia-nál, kolorimetrikus úton határoztuk meg. Az elemzés során kapott érték kisebb az elméleti értéknél, ugyanis az acetilaceton felszabadítása közben az acetilaceton egy része elbomlik.) 7
