161173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok előállítására
161173 11 12 A találmány oltalmi körébe tartozó további eljárásváltozattal szennyezésmentesen állíthatjuk elő az (IA), ill. (IB) általános képletű vegyületeket. Ezt az eljárásváltozatot a 2. reakcióvázlatban ismertetjük. A reakció első lépésében a (II) képletű inzulint keverés közben, két, egymással nem elegyedő fázisból álló heterogén vizes közegben, enyhén lúgos pH-értéken, fenol vagy helyettesített fenolszármazék jelenlétében Z—CO—CH2— CO—R általános képletű /?-diketonnal reagáltatjuk. A reakció első szakaszában (VI) általános képletű alkálifémsó és (III) általános képletű alkálifémsó elegye képződik. Az elegy vízben oldhatatlan, és erősen asszociált molekula-aggregátumokból épül fel. Az így kapott elegyet pH~8 értéken fenollal vagy helyettesített fenol-származékkal kezeljük. A disszociációs reakció lezajlása után (VII) általános képletű, vegyületből és (IA) általános képletű vegyületből álló, vízben oldódó, disszociált vagy gyengén asszociált molekulákat tartalmazó elegyet kapunk. A második lépésben a (VII) és (IA) általános képletű vegyületek elegyét az első lépésben alkalmazott körülmények között, gyengén lúgos közegben Z—CO—CH2— CO—R általános képletű /?-diketonnal reagáltatjuk. A reakció során (III) általános képletű alkálifémsókat kapunk. A (III) általános képletű vegyület molekulái erősen asszociált molekulaaggregátumokat képeznek, így a vegyület sem a reakcióközegben, sem vízben (pH = 1—10 értéken) nem oldódik. Ha az erősen asszociált (III) általános képletű vegyületeket fenollal vagy helyettesített fenolszármazékokkal kezeljük, (IA) általános képletű alkálifémsókhoz jutunk. A kapott termékek diszszociált molekulákat képeznek, és kromatográfiás elemzéssel kimutatható szennyezéseket nem tartalmaznak. A következőkben a találmány szerinti eljárás egyik igen előnyös kiviteli módjának részleteit ismertetjük. A (II) képletű inzulin és a yS-diketon kondenzációját heterogén vizes közegben, alkohol, pl. etanol jelenlétében hajtjuk végre. A megfelelő pH-érték biztosítása céljából a reakcióelegyhez pufferelegyet, pl. di-alkáli-foszfát-mono-alkálifoszfát-elegyet, vagy előnyösen alkáli fémhidrogénkarbonátot, pl. káliumhidrogénkarbonátot adunk. A heterogén reakcióközegben levő inzulin aminő-csoportjai igen gyorsan, és csaknem teljes mértékben oxoenamino-csoportokká alakulnak, míg az arginin-rész guanidil-csoportja lényegesen lassabban reagál. A reakció során ennek megfelelően (VI) és (III) általános képletű vegyületből álló csapadékelegy képződik. A csapadékelegy a reakcióközegben, ill. vízben (pH = 1— 10 érték között) oldhatatlan molekula-aggregátumokat képez. Ha a reakció során az inzulint acetilacetonnal reagáltatjuk, a következő összetételű elegyekben hajthatjuk végre a kondenzációt: Kálium-Inzulin hidrogénkarbonát Víz Acetilaceton Fenol Etanol l_2 o/ 0 3-6% 28% 24% 24% 18% 1-2% 3-6% 28% 28% 28% 9% A fenti elegyekben a fenol és az alkohol arányát úgy választottuk meg, hogy a (VI) és (III) 10 általános képletű vegyületből álló csapadékelegy a közegben teljesen oldhatatlan legyen. A találmány oltalmi körét nem korlátozzuk a fent ismertetett összetételű elegyek alkalmazására. A csapadékelegyben a (VI) és (III) általános 15 képletű vegyület alkálifémsója formájában van jelen. A vegyületek alkálifém tartalma rendszerint kisebb, mint az elméleti érték (molekulánként 6 alkálifématom), ugyanis pH = 8 értéken a hat karboxil-csoport sóvá alakulása nem megy 20 teljesen végbe. A (VI) és (III) általános képletű vegyületet tartalmazó csapadékelegy pontos összetételét nem ismerjük, és azt sem tudjuk jelenleg, hogy a csapadékban (III), ill. (VI) általános képletű vegyü-25 letekből felépített, tiszta molekula-aggregátumok, vagy (III) és (VI) általános képletű vegyületekből felépített vegyes molekula-aggregátumok vannak-e jelen. Teljes bizonyossággal csak anynyit állíthatunk, hogy a csapadék (III) és (VI) ál-30 talános képletű vegyületekből áll és vízben oldhatatlan. Az inzulin és ^-diketon heterogén fázisban végrehajtott kondenzációja során a reakcióelegyet igen erélyesen kell keverni. Megfelelő eredményt 35 érünk el, ha a reakcióelegyet 200—200 fordulat/ perc forgássebességű keverővel keverjük. Ha a fenol és alkohol aránya a reakcióelegyben 10:35 (egy fázis), vagy 50:5, a csapadékelegy az előzőnél lényegesen jobban oldódik a reakció-40 közegben, és a reakció sebessége fokozódik, mindkét esetben azonban a reakció végén kapott (IA) általános képletű vegyület az előzőektől kismértékben eltér. Ennek következtében egységes szerkezetű vegyület előállítása érdekében a reakció-45 elegy fenol:alkohol arányát csak szűk határok között változtathatjuk. A reakció optimális hőmérséklete. — a homogén-közegben végzett reakcióéhoz hasonlóan — 20—25 C° közötti érték. Ezen a hőmérsékleten 50 a guanidil-csoport átalakulásának sebessége viszonylag kis érték. Ha reagensként acetilacetont alkalmazunk, heterogén-közegben, 20 napos keverés után a guanidil-csoportok 30%-a még nem lépett reakcióba. 55 Magasabb hőmérsékleten, vagy a vegyületeket jobban oldó oldószerek jelenlétében a reakció sebessége fokozódik ugyan, azonban nem kapunk egységes terméket. A guanidil-csoportok reagálatlan 30%-ának 60 blokkolása érdekében tehát — ha el akarjuk kerülni a termék szennyeződését — nem fokozhatjuk a reakciósebességet. Ebben az esetben a reakciót úgy tehetjük teljessé, hogy a (VI) és (III) általános képletű vegyületek elegyét fenollal vagy 65 helyettesített fenol-származékkal kezeljük gyen-6
