160758. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klinikai célokra alkalmas, infektálható inzulinkészítmény előállítására
11 A gyantát 130 cm magas, 15 cm átmérőjű oszlopba töltjük, és az oszlopot 1 M ecetsav-oldattal egyensúlyba hozzuk. 10 g, citrát-pufferból egyszer kristályosított inzulint 390 ml 1 M ecetsav-oldat és 8 ml 1 M 5 sósavoldat elegyében oldunk, és az oldatot felvisszük az oszlopra. Az oszlopot 1 l/óra sebességgel, 1 M ecetsav-oldattal eluáljuk, és az átfolyó folyadékból 200 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. je A frakciók extinkcióját 276 nm-nél megmérjük, és az extinkciót a frakciószám függvényében grafikusan ábrázoljuk. Az inzulin-csúcs (legnagyobb csúcs) központi tartományának megfelelő frakciókat egyesítjük, és az inzulint lg 200 g/l NaCl hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással. elkülönítjük, izoelektromos kicsapásnak vetjük alá, és acetont tartalmazó citrátpufferből ismert módon kristályosítjuk. 8 g kristályos, kb. 6000-nél nagyobb, pancreas-eredetű fehérjéktől mentes inzulint . kapunk. 2. példa: „. Az 1. példa szerint előállított, tisztított kristályos inzulint Amberlite ioncserélő gyantán ioncserés kromatográfiával tovább tisztítjuk. 7 M karbamid-oldatot készítünk, és az oldatot sc vegyes ágyú ioncserélő gyantaoszlopokon (Amberlite MB—1) átbocsátva ionmentesítjük. Az így kapott ionmentesített karbamid-oldatot használjuk fel a pufferoldat előállításához. 1% n-butanolt tartalmazó, 0,13 M nátriumfoszfát — g5 7 M karbamid-oldatot állítunk elő, az oldat pH-ja 25 °C-on 6,00. A pufferoldatot -f-4 °C-on tároljuk, és ugyanezen a hőmérsékleten használjuk 1,5 kg II. típusú Amberlite CG 50 ioncserélő gyantát egymás után vízzel, aceton- .„ nal, vizes NaOH-oldattal, vízzel, vizes sósavoldattal, majd ismét vízzel kezelünk, majd a kimosott gyantát 5 liter pufferoldattal keverjük. A szuszpenzió pH-ja azonnal lecsökken. A szuszpenzióhoz néhány perces időközökben kb. 30—30 ml 40%-os nátriumhidroxid-oldatot adunk, és így az elegy pH-ját kb. 6,00 értéken tartjuk. Amikor az elegy pH-ja 15 perces keverés után is 6,00 értéken marad, az elegyet éjszakán át 4 °C-on keverjük. A gyantát szűrjük, és 8 órán át 30 liter pufferoldattal mos- a suk. A mosás végén az átfolyó folyadék pH-jának meg kell egyeznie a betáplált pufferoldat pH-jával. Az így kapott gyantát 7.5 cm átmérőjű, 80 cm magasságú oszlopba töltjük, és az oszlopot a pufferoldattal egyensúlyba '"" hozzuk. 15 g, az 1. példa szerint előállított inzulinból a pufferoldattal 10 súly%-os oldatot készítünk, és az oldatot felvisszük az oszlopra. Az oszlopot 4 °C-on, 200 ml/óra sebességgel a fenti pufferoldattal eluáljuk, és az eluátumból 100 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. A frakciók extinkcióját 276 nm-nél megmérjük, és az extinkciót a frakciószám függvényé- 65 12 ben grafikusan ábrázoljuk. Az inzulin-csúcs (a legnagyobb csúcs) központi tartományának megfelelő frakciókat egyesítjük, és az inzulint 1 liter oldatra számított 2 liter víz, 15 ml 4 N sósavoldat és 600 g NaCl hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük, izoelektromos kicsapásnak vetjük alá, és ismert módon aceton-tartalmú citrátpufferből kristályosítjuk. 10 g kristályos, poliakrilamid-gél-elektroforézis alapján csak egyetlen komponenst tartalmazó inzulint kapunk. A kapott kristályos termék tehát tiszta inzulinnak tekinthető. 3. példa: A következő összetételű pufferoldatot állítjuk elő. 0,1 M NH4 C1, 0,02 M NH3 , 60 térf.% etanol. Az oldat pH-ja 25 °C-on 8,3. A pufferoldatban 15 g 50/100 mesh szemcseméretű Dowex 1x2 ioncserélő gyantát duzzasztónk, és a finomabb részecskéket dekantálással eltávolítjuk. A kapott gyantát 1,6 cm átmérőjű, 25 cm magasságú oszlopba töltjük, és az oszlopot a pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. 500 mg, citrát-pufferből egyszer kristályosított inzulint 200 mg etiléndiamin-tetraecetsav-dinátriumsó, 5 ml pufferoldat, 5 ml 60 térf.u /oos etanol és 0,04 ml 13,3 M NH3 elegyében oldunk. Az elegy pH-ja 8,5. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk, és a tiszta oldatot felvisszük az oszlopra. Az oszlopot 25 °C-on 7,5 ml/óra sebességgel a fenti pufferoldattal eluáljuk, és az eluátumot 5 ml-es frakciónként összegyűjtjük. A frakciók extinkcióját 276 nm-nél megmérjük, és az extinkciót a frakciószám függvényében grafikusan ábrázoljuk. Az inzulin-csúcs (legnagyobb csúcs) középponti tartományának megfelelő frakciókat egyesítjük, és az inzulint 100 ml oldatra számított 100 ml víz, 1,3 ml 1 N HCl és 2 ml 1 M cinkacetát hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással el-* különítjük és ismert módon acetát-tartalmú citrátpufferből kristályosítjuk. 200 mg tiszta inzulint kapunk. 4. példa: A következő összetételű pufferoldatot állítjuk elő: 2,5 liter 7 M karbamid-oldat (a 2. példában leírt módon ionmentesítve), 31,3 g trisz-(hidroximetil)-aminometán, 36,3 ml 6 N HCl. A pufferoldat pH-ja 25 °C-on 7,9. A pufferoldatban 40 g QAE-Sephadex—A—25 ioncserélő gyantát (a Pharmacia, Uppsala, svédországi cég gyártmánya) duzzasztunk, és a finomabb részecskéket dekantálással eltávolítjuk. A gyantával 2,5 cm átmérőjű, 25 cm magasságú oszlopot töltünk meg, és az oszlopot a pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. 500 mg, citrátpufferből egyszer kristályosított inzulint 5 ml pufferoldat és 5 ml 7 M karb-6
