160758. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klinikai célokra alkalmas, infektálható inzulinkészítmény előállítására
13 amid-oldat elegyében oldunk, és az oldat pH-ját szilárd trisz-(hidroximetil)-aminoimetánnal 7,9-re állítjuk. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk, és a tiszta oldatot felvisszük az oszlopra. Az oszlopot 4 °C-on, 30 ml/óra sebességgel a fenti pufferoldattal eluáljuk, és az eluátumot 5 ml-es frakciónként öszszegyűjtjük. A frakciók extinkcióját 276 nm-en megmérjük, és az extinkciót a frakciószám függvényében grafikusan ábrázoljuk. Az inzulin-csúcs (legnagyobb csúcs) központi tartományának megfelelő frakciókat egyesítjük, az oldatot térfogatával azonos mennyiségi vízzel elegyítjük, az elegy pH-ját sósavval 2,8-ra állítjuk, és az elegyhez az eredeti térfogat kétszeresének megfelelő mennyiségű telített nátriumklorid-oldatot adunk. A kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük, izoelektromos kicsapásnak vetjük alá, és aoeton-tartalmú citrátpufferből ismert módon kristályosítjuk. 200 mg tiszta inzulint kapunk. 5. példa: 25 A következő összetételű pufferoldatot állítjuk elő: 25 g trisz-(hidroximetil)-aminometán, 29,0 ml 6 N HCl, 1,2 liter metanol, víz (ad 2 1). A pufferoldat pH-ja 25 °C-on 7,3. A pufferoldatban 40 g QAE-Sephadex—A—25 30 ioncserélő gyantát duzzasztunk, és a finomabb részecskéket dekantálással eltávolítjuk. A gyantával 2,5 cm átmérőjű, 25 om magasságú oszlopot töltünk meg, és az oszlopot a pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. s5 500 mg, citrát-pufferből egyszer kristályosított inzulint 20 mg etiléndiamin-tetraecetsav-dinátriumsó, 94 mg trisz-(hidroximetil)-aminometán, 10 ml 60 térf.%-os metanol és 0,073 ml 6 N HCl elegyében oldunk. Az oldat pH-ja 7,3. 40 Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk, és a tiszta oldatot felvisszük az oszlopra. Az oszlopot 25 °C-on, 30 ml/óra sebességgel a fenti pufferoldattal eluáljuk, és az eluátumot 5 ml-es frakciónként összegyűjtjük. 45 A frakciók extinkcióját 276 nm-en megmérjük, és az extinkciót a frakciószám függvényében grafikusan ábrázoljuk. Az inzulin-csúcs (legnagyobb csúcs) központi tartományának megfelelő frakciókat egyesítjük, és az inzulint 100 ml oldatra számított 100 ml víz és 2 ml 1 M cinkaoetát hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük és acetonlartalmú citrátpufferből ismert módon kristályo- 55 sítjuk. 250 mg tiszta inzulint kapunk. 6. példa: 60 A következő összetételű pufferoldatot állítjuk elő: 0.03 M trisz-(hidroximetil)-aminometán, 0,02 N HCl, 0,075 M NaCl, 60 térf.%-os etanol. A pufferoldat pH-ja 25 °C-on 8,3. gs 14 A pufferoldatban 80 g QAE-Sephadex—A—25 ioncserélő gyantát duzzasztunk, és a finomabb részecskéket dekantálással eltávolítjuk. A gyantával 2,5 cm átmérőjű, 50 cm magasságú oszlopot töltünk meg, és az oszlopot a pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. 2,5 g citrát-pufferből egyszer kristályosított inzulint 0 °C-on 450 mg trisz-(hidroximetil)-aminometán, 100 mg etiléndiamin-tetraecetsav-tetranátriumsó, 25 ml pufferoldat, 25 ml 60 térf.%-os etanol és 0,80 ml 4 N HCl elegyében oldunk. Az oldat pH-ja 25 °C-on 8,4. Az oldhatatlan anyagot 2—4 °C-on centrifugálással eltávolítjuk, és a tiszta oldatot felvisszük az oszlopra. Az oszlopot 4 °C-on, 26 ml/óra sebességgel a fenti pufferoldattal eluáljuk, és 20 mles eluátum-frakciókat gyűjtünk össze. A frakciók extinkcióját 276 nm-en megmérjük, és az extinkciót a frakciószám függvényében grafikusan ábrázoljuk. Az inzulin-csúcs (legnagyobb csúcs) központi tartományának megfelelő frakciókat egyesítjük, és az inzulint az oldattal azonos térfogatú 0,02 M cinkacetát és 0,03 N HCl hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük, és ismert módon, aceton-tartalmú citrátpufferből kristályosítjuk. 1,3 g tiszta inzulint kapunk. 7. példa: A következő összetételű pufferoldatot állítjuk elő: 14,9 g hisztidin-monoklorid, 33,7 ml 1 N NaOH, 16,1 g NaCl, 3,12 liter 93 térf.'Vo-os etanol, víz (ad 5 liter). A pufferoldat pH-ja 25 °C-on 6,5. A pufferoldatban 35 g QAE-Sephadex—A—25 ioncseré1 ő gyantát duzzasztunk, és a finomabb részecskéket dekantá^ssal eltávolítjuk. A gyantával 2.5 cm átmérőjű, 25 cm magasságú oszlopot töltünk meg, és az oszlopot a pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. 500 mg, citrát-pufferből egyszer kristályosított inzulint 20 mg etiléndiamin-tetraecetsav-dinátriumsó, 6,5 ml pufferoldat és 6 ml térf. %-o:s etanol elvében oldunk, és az oldat pH-ját 1 N NaOH-dal '6.8-ra állítjuk. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk, és a tiszta oMatot felvisszük az oszlopra. Az oszlopot 25 °C-on. 30 mVóra sebességgel eluáljuk a fenti pufferoldattal. és az eluátumot 5 ml-es frakcióként összegyűjtjük. A frakciók extinkcióját 276 nm-nél megmérjük, és az extinkciót a frakciószám függvényében grafikusan ábrázoljuk. Az inzulin-csúcs (legnagyobb csúcs) központi tartományának m=3"£a1 el ő frakciókat egyesítjük, és az inzulint az oldattal azonos térfogatú 0.02 M cinkacetáttal kicsaoiuk. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük, és ismert módon, acetát-tartalmú citrátpufferből kristályosítjuk. 210 mg tiszta inzulint kapunk. 7
