160696. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tromboplasztin kinyerésére

3 160696 4 telezhető módon teszi lehetővé tromboplaszitin gazdaságos kinyerését. A találmány alapja az a felismerés, hogy a tromboplasztikus lipoprotein különféle és különböző eredetű állati vagy emberi parenchimás Szervekből vizes közegben hidrogén-kötés képzésére hajlamos vegyületekkel kalcium-ionok jelenlétében az eddig ismert eljárásoknál lényegesen hatékonyabban vonható ki, g az így nyert kivonatokból teljes mennyiségében könnyen kicsapható, elkülöníthető. A találmány eljárás trombopiasztin kinyerésére emlősök tromboplasztin-tartalmú parenchimás szöveteiből, amely abban áll, hogy a trornboplasztin kivonását hidrogénkötés képzésére hajlamos vegyületekkel kalcium-ionok jelenlétében végezzük, majd a tromboplasztint a kivonatból kicsapjuk és elkülönítjük. Hidrogénkötés képzésére hajlamos vegyületként eJőnyösen használhatunk karbamidot és/vagy guanidint. A találmány szerinti eljárás egy előnyös f oganatosítási módja szerint a tromboplasztin kivonását 0,5—5,0 mól/liter töménységű karbamiddal és/vagy guanidinnal 0,02—0,5 mól/liter kalcium-ionkoncentráció jelenlétében 0 C° és 25 C° közti hőmérsékleten pH 6,0—8,0 határértékék között végezzük. Az oldatlan szövetmaradék elkülönítése után a tromboplasztint neutrális sóval, előnyösen konyhasótelítéssel csapjuk ki a kivonatból, majd elkülönítjük és fagyasztott állapotból szárítjuk. A találmány szerinti eljárás értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy 1 súlyrész megdarált, vértől kimosott szervhez 10 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten 0,1 mól/liter kalcium-kloridot tartalmazó és 1,5—2-szeres térfogatú 1-mólos karbamid oldatot adunk, s a szervdaráiékot késes őrlőberendezésben (pl. Turmix) 5—10 percen át nedvesen őröljük. A tromboplasztin kivonását a fenti hőmérsékleten mechanikus keverés közben folytatjuk 30 percen át, majd az oldatlan szervmaradéköt centrifugálással és/ vagy szűréssel távolítjuk el. A kivonást a fenti körülmények között megismételjük, a szervmaradék elkülönítése után a két kivonatot egyesítjük, térfogatát lemérjük, hidrogénion-koncentráeióját 2-mólos ecetsavval pH 4,5—4,8 közé állítjuk be és literenként 300 gramm konyhasót adunk hozzá állandó keverés közben. Az elegyet 30—60 perc időtartamú lassú keverés után 2— 4 C° hőmérsékleten. 12—16 órán át hagyjuk állni, majd ugyanilyen hőmérsékleten centrifugáljuk. Centrifugálás után a felülúszót elöntjük, a csanadékban levő tromboplasztint kalcium-ionokat tartalmazó desztillált vízben szuszOendáljuk, s ugyanilyen oldószerrel szembea dializáljuk, a konvhasó eltávolítása céljából. A dialízis befejeztével a tromboplasztin-szuszpenziót homogenizáljuk, fagyasztott állapotból szárítjuk, végül tablettázzuk. A találmány szerinti eljárásnak a korábbi tromboplasztin kinyerési eljárásokkal szemben előnye, hogy kevesebb lépésben rendkívül egyszerű és könnyen kivitelezhető módon teszi lehetővé protrombintól és plazminogéntól, valamint más véralvadási tényezőktől mentes trom-5 boplasztin-készítmény ipari méretekben is gazdaságos, az ismert eljárásoknál jobb kitermelést nyújtó előállítását. A találmány szerinti eljárás foganatosítására 10 az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa 2 kg feldarabolt, a vértől és a hörgőktől megl* szabadított marhatüdőt húsdarálón megdarálunk, majd 5 liter 2—4 ,C° hőmérsékletű csapvízzel mosunk. A mosást 4—5-ször megismételjük, hogy a vérnyomokat is eltávolítsuk. A szürkésszínű hideg szervdaráiékot hűtőszobában 4— 20 8 perc időtartamú őrlés (Turmix) közben 5 liter olyan oldószerrel kivonatoljuk, amely literenként 1 mól karbamidot és 0,06 mól kalcium-kloridot tartalmaz, őrlés után lassú keverés közben 1—2 órán át folytatjuk a kivonást, majd a 25 kivonó elegyet 4 C°-on 6—12 órán át hűtőszobában tároljuk és ezután centrifugáljuk. A szervmaradékot a fenti módon újra kivonatoljuk. Az egyesített kivonat pH-ját 5-mólos ecetsavval 4,5 és 4,8 közé állítjuk be, majd a kivo-30 nathoz literenként 300 g vegytiszta kristályos konyhasót adagolunk kis részletekben, állandó keverés közben. A kicsapási elegyet 4 C°-on 4— 6 órán át állni hagyjuk, majd ugyanilyen hőmérsékleten centrifugáljuk. A fölülúszót elönt-35 jük, a tromboplasztint tartalmazó csapadékot 200 ml 0,02 mól glikollt és 0,02 mól kalciumiont tartalmazó oldószerben felszuszpendáljuk, és 10-szeres mennyiségű ugyanilyen összetételű oldószerrel szemben keverés közben 4 C°-on 40 dializáljuk. A külső térben az oldószert 2—»3 óránként cseréljük, s a dialízist mindaddig folytatjuk, amíg a külső térben a klorid-reakció negatívvá nem válik. Az ily módon kiegyensúlyozott elegyet centrifugáljuk, a fenti oldószer 100 45 ml-ével homogenizáljuk és fagyasztott állapotból szárítjuk. A hozam 24,6 g (12,3 g/kg tüdő) világos drapp — színű tromboplasztin-por, amelynek biológiai 50 aktivitása invitro mind az egyszakaszos [Quick, A. J.: Clotting Compass. Thromb. Diath. Haem. 3, 202 (1959)], mind pedig a kétszakaszos prothrombin-meghatározási reakcióelegyben [Ware, A. G. és Seegers, W. H.: Am. J. Clin. Pathol, 55 19, 471 (1949)] jól megegyezik a kalcium-ionokkal stabilizált standardként használt Geigy-féle tlhrombokináz aktivitásával. A végtermék hozama 50—80%-kal nagyobb, mint az élettani konyhasós kivonással azonos kiindulási nyersanyagból előállított készítményé. 60 2. példa 1 kg marhatüdőt az 1. példa szerinti módon 65 tisztítunk, darálunk és gyakorlatilag vérmentes-2