160622. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz stabilizálására

5 160622 6 2. példa: 5 g 3,2 egység/mg aktivitású nyers aszparaginázt 100 ml 1%-os {g/ml), hátroíilúggal 8,3 pH-értékűre beállított alaninoldatban feloldunk és 15 percig 60 °C hőmérsékleten melegítjük. Az elegyet, amely sok denaturált proteint tartalmaz, 6000/perc fordulatszám mellett centrifugáljuk. A tiszta oldat a teljes mennyiségű aktív ászparaginázt tartalmazza. A további feldolgozást az 1. példában leírtak szerint végezve a kapott elegyből ugyancsak kristályos L-aszparagináz nyerhető. 3. példa: 5 g kb. 170 egység/mg aktivitású L-aszparagiházt szobahőmérsékleten 1 liter vízben feloMunk, a fel nem oldódott részecskéket céhtrifugálással eltávolítjuk. Az így kapott oldatot szobahőmérsékleten lassú keverés közben 10 g glikokollal hozzuk össze. Az oldatot állandóan továbbkeverjük, megfagyasztjuk, végül liofilizáljuk. A glikokoll hozzáadása után a pH-értéket 5,2-re állítjuk be. A polietilénglikol stabilizáló hatása a következő példákból látható: 4. példa: L-aszparagiház preparátumot dextrángél oszlopon- frakcionálunk és az L-aszparagináz tartalmú frakciót dializáljuk. Az oldat összesen 12,400 egységnyi, 251 egység/mg protein specifikus aktivitású anyagot tartalmaz. Az oldat egyik felét fagyasztva szárítjuk. A kapott preparátum összáktMtása 5050 egység (a kiindulási összaktivitás 81%-a; a specifikus aktivitás 202 egység/mg protein). A fenti oldat másik feléhez 0,1 ml 50%-os polietilénglikolt adunk és ezt követően fagyasztva szárítjuk. A kitermelés 6100 egység (a kiindulási összaktivitás 98%-a), 244 egység/ /mg protein specifikus aktivitású anyag. 5. példa: 5—5 ml 0,1%-os (g/ml) L-aszparagináz oldatot, amely 146 egység/mg aktivitású anyag 0,2 normál acetátpufferben való oldásával készült, és pH-értéke 5,0, az alábbi kísérleteknek vetünk alá: a) 90 percen át tiszta argon gázt úgy buborékoltatunk át az oldaton, hogy intenzív habképződés lépjen fel. b) Az oldatot áz a) alatti eljárás szerint kezeljük, de ezt megelőzően 100 mg 1500-as mólsúlyú polietilénglikolt adunk hozzá, c) Az oldatot 3 órán át zárt edényben rázzuk. d) Áz oldatot a c) alatti eljárás szerűit kezeljük, de előzőleg 100 mg pbliétiiéngllkólt adunk hozzá. e) Az öldátöt 3 órán át hűtőszekrényben tároljuk (kontroll vizsgalat). f) Az oldathoz 100 mg 1500-as mólsúlyú polietilénglikolt adunk, majd 3 órán át hűtőszekrényben tároljuk. 10 Az á)—f) oldatok tartalom meghatározása az alábbi eredményeket adja: a) egység/ml — 15 15 b) egység/ml =140 c) egység/ml == 35 d) egység/íml «s 138 20 e) egység/ml = 146 f) egység/ml =144 6. példa: 5—^5 ml 0,1%-ös L-aszparagináz oldatot, amely 146 egység/mg aktivitású anyag 1/1S mólos 30 foszfátpufferben való oldásával készült, és pH értéke 7,0, az 5. példa a) és b) alatti eljárása szerint kezelünk. A tartalommeghatározás eredménye: 35 a) egység/ml^ 76 b) egység/ml —145. 7. példa: 100 egység/mg aktivitású L-aszparagináz preparátumot 0,1 mólos triszpuffeíbén (pH = 8,0) feloldunk úgy, hogy a koncentráció 1 mg/ml legyen. 6,0 ml ilyen oldatot 0,5 ml vízzel hígítunk és termosztátban 55 °C hőmérsékleten tartjuk. Egyidejűleg ugyanezen L-aszparaginázoldat 6,0 ml-ét 0,3 ml vízzel és 0,2 ml 50%-os vizes polietilénglikol oldattal összekeverjük és a fentivel azonos hőmérsékleten tartjuk. Meghatározott idő után az elegyekből mintát veszünk és meghatározzuk azok aktivitását. Az eredményeket az I. táblázat tartalmazza-Ugyanebből az L-aszparagináz preparátumból teljesen azonos mintákat 60 °C hőmérsékleten tartva vizsgálunk. Áz eredményeket szintén az I. táblázat tartalmazza. DU 8. példa: Kb. 100 egység/mg aktivitású L-aszparagináz preparátumot 0,1 normál triszpufferben (pH== 6i) = 8,0) feloldunk úgy, hogy a koncentráció 3