160622. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz stabilizálására

I 160622 4 bomlását idézi elő. Ei utóbbi eset pl. igen könnyen előfordul rázás során vagy laérs gáz bevezetése során bekövetkező habképződésnél-Egy enzim oldatának már egyszerű átöntése egyik edényből a másikba is észlelhető aktivitás csökkenéssel jár. A felületi denaturálódás az izoelektromos ponton különösen világosan jelentkezik, amint ez a tény az irodalomból is ismert. Továbbá tudott dolog, hogy a tisztított fehérjék érzékenysége a tisztaság fokával növekszik és az igen tiszta preparátumok különlegesen érzékenyek a dehatuíátódást előidéző hatásokkal szemben. Egy, az L-aszparagináz stabilizálására szolgáló eljárást találtunk, amely két különböző anyagnak az L-aszparagináz oldathoz való adagolásából áll. A két anyag bármelyike már világosan észlelhető stabilizáló hatást fejt ki, kombinációjuk azonban különösen célravezető. A találmány szerinti eljárásnak az a lényege, hogy L-aszparagináz oldatához aminosavat, előnyösen gliktíköllt és/Vagy polietilénglikolt adnak hozzá. Már magában az aminosavnak, előnyösen glikokollnak, az adagolása is az alábbi előnyökkel jár: 1. 60 °C hőmérsékletig történő melegítés során is megmarad a teljes enzim aktivitás; a melegítés időtartamát nem szükséges pontosan betartani. 2. A szárított, illetve liofilizált enzim oldhatósága javul. Ez a. tény azon alapszik, hogy az L-aszparagináz részleges denaturálódása teljesen háttérbe sfeorul. A találmány szerinti eljárás végrehajtása során az aszpafaginázs oldatához —10 °G és -(-65 °C közötti hőmérsékleten 0,01^-5,00 százaléknyi mennyiségű aminosavat adunk. 60 °C körüli hőmérsékleten a kísérő proteinek denattiíálódnak. A melegítés ideje 10 perctől 4 óra hosszáig terjedhet. A kapott oldat tartalmazza az aktív L-aszparaginázt. Ez az oldat eléggé tiszta ahhoz, hogy az L-aszparaginázt tovább tisztításához kiindulási anyagként szolgáljon. A meglepő az, hogy a találmány szerinti tisztítási eljárás során csak az inaktív kísérő proteinek dénaturálódftafcf

ai L-äszparagiriäz pedig nem, holott ismeretéitik Sjsérint a légtöbb enzim hőre érzékeny, Ennek a stabilizálásra szolgáló eljárásnak a már hivatkozott korábbi tisztítási eljárásokkal való kombinációja útján tiszta, kristályos L-aszparagmázt állíthatunk élő. Már a polietiléhglikólnak egymagában történő adagolása is stabilizálja az L-áözparaginázt különféle dertaturálödási módokkal szembén. Ez az eredmény azért meglepő, mért a polietiléngükol nem kifejezettén felületaktív hatású, amely a habképződés gátlása utján tudná a felületi deriatürálódást háttérbe szorítani. Ellentétben a fentiekben stabilizátorként javasolt glíeihnél a polietiléngükol az étér-oxigénen ázábad élektronpárokkal rendelkezik, gyakorlatilag azonban nincs hidrogénhíd képzésre al-5 kalmas hidrogénatomja. Ez a stabilizáló hatás különböző tisztaságú aszparaginázok esetén lép fel. Az adagolt polietiléngükol koncentrációja tág határok között változhat. A stabilizáló hatás már az L-aszparaginázra számított 10 szá-10 zaléknyi adalék esetén világosan bizonyítható. A polietilénglikolt az L-aszparagináz oldathoz mind óidat (ez előnyösen vizes, de alkoholom oldat is itehet), mind szilárd anyag formájában hozzá adhatjuk. 15 Az enzimnek glicinnel történő stabilizálását ä polietiléngükol adagolás különösen előnyös módon megerősíti. Példa: stabilizálás aminosavval. 20 1- példa: 50 g 3,2 egység/mg aktivitású, nyers aszparaginázt 8,5 pH-értékű gÜkokoll-jpufferben fel-2S oldunk, és 1 órán át 60 °G hőmérsékleten melegítjük. Az üledéket, amely sok denaturált, inaktív proteint tartalmaz, 6000/perc fordulatszám mellett centrifugáljuk és acetonnal frakcionáljuk. A 40—45% aceton hozzáadásakor ki-30 váló rész súlya 3,9 g, amelynek aktivitása 32 egység/mg. ^ Több denaturálási mintából származó, egyesített 18,6 g tisztított L-aszparaginázt 380 ml 3 mólos karbamidoldatban feloldunk, normál 3S nátronlúggal a pH-értéket

8,5-re állítjuk be és 50%ros polietiléhgükol-oldattal frakcionáljuk. A 45—60 ml hozzáadásakor kiváló részt lecentrifugáljuk, acetonnal kimossuk és megszárítjuk. Kitermelés: 4,2 g. Aktivitás: 104 egy, to ség/mg. Ebből á mintából 4 g-ot 80 ml kétszer desztillált vízben feloldunk, az oldat pH-értékét 5,2-re álütjük be, és polietiléngükol oldattal frakcionáljuk. A 25—30 ml hozzáadása után ki-45 váló részt 20 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, lecentrifugáljuk és két órai acetonban történő áztatás után további acetonnal kimossuk. Kitermelés: 1,2 g. Aktivitás: 204 egység/mg. 50 A minta egységesen átkristályosított anyagnak bizonyult. További átkristályosítás hajtható végre a) a kristályokat vízbéri feloldva, majd 4,9 pH-értéken polietiléngliköl-oldattal kicsapva, ill. 5 b) ugyancsak vizes oldatból történő acetonos kicsapással. Lapos prizmák; bomlási hőmérséklet: 289 °G, teljes bomlás 292 °C-ori. Az enzim aktivitását mg enzimre vónatkoztátva adtuk meg. Égy egységesen azt az enzimmennyiséget értjük, amely 37 °C-on és 7,2 pH-értéken L-aszparagin oldatból egy perc alatt 1 femól ammóniát tesz szabaddá; az ammóniát Nessler-reagenssel mérjük {Cancer Research 2S, 65 2213—17. (1968)]. 2