160180. lajstromszámú szabadalom • Eljárás adenozin-5'-difoszfát előállítására
160180 A találmány további alapja az a felismerés, hogy ha a glükózt élesztő-készítmény jelenlétében szervetlen foszfáttal, majd adenozinnal reagáltatjuk, ATP, ADP és adenozin-5'-monofoszfát (a továbbiakban: AMP) elegye helyett ADP és AMP elegyét kapjuk, ha a reakció befejezése előtt a reakcióelegyhez további glükóz-mennyiséget adunk, és a reakciót a glükóz hozzáadását követően rövid időn belül leállítjuk. Ez a felismerés azért meglepő, mert ha a kiindulási glükóz-menynyiséget növeljük oly mértékben, hogy a találmány értelmében a reakció végén hozzáadott glükóz mennyiséget a reakció elején adagoljuk, a végtermék összetétele nem változik, vagyis továbbra is ATP, ADP és AMP elegyét kapjuk. Végül a találmány alapja az a felismerés, hogy ha összekapcsoljuk az Ostern-féle és a Neubergféle rendszert, speciális glükóz-adagolás révén lehetővé válik a reakciórendszer foszforilező tevékenységének szabályozása és ennek révén a keletkezett ADP mennyiségének növelése. Ez a felismerés azért meglepő, inert a 15 szimultán végbemenő reakció lefolyásának a kívánt irányban való befolyásolása roppant bonyolult mechanizmuson alapszik. A találmány eljárás adenozin-5'-difoszfát (ADP) előállítására glükóznak élesztő-készít-. meny jelenlétében szervetlen foszfáttal, majd adenozinnal való reagáltatása, a foszforilezési reakció befejeződése után az enzimes folyamatok leállítása és a. képződött ADP elkülönítése útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a reakcióelegyhez a foszforilezési reakció befejeződése után, de az enzimes folyamatok leállítása előtt legalább 0,2 s/tf%, célszerűen 1—3 s/tf% glükózt adagolunk. A reakciót sav, így sósav vagy triklórecetsav hozzáadásával vagy melegítéssel célszerű leállítani. Az ADP-t célszerűen ioncserével különíthetjük el a reakcióelegyből. Az így kapott termék alkalmas biológiai és biokémiai kutató munkákban való felhasználásra inozin-5'-difoszfát laboratóriumi és ipari előállításának alapanyagaként, valamint adenozin-tartalmú szintetikus polinukleotidok enzimes szintézisének monomerjeként. A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a glükózt élesztő-készítmény jelenlétében szervetlen foszfáttal, majd adenozinnal reagáltatjuk, és foszforilezési reakció befejeződése után 1—3 s/tf% glükózt adagolunk a reakcióelegyhez. Ezt követően a r^kciót 2—8 percen belül leállítjuk olyan módon, hogy a reakcióelegy pH-ját sósavval 2 alá csökkentjük, majd 2—3 s/tf% triklórecetsavat adunk hozzá. Az ADP elkülönítését a kivált fehérjék eltávolítása után alkoholos kicsapással, majd a csapadék vizes oldásával kapott oldatnak anioncserélő gyantán való savanyú frakcionálásával végezzük. A találmány a korábbi eljárásokhoz képest jelentős műszaki haladást biztosít, mert egybekapcsolja a Neu'bergHféle fruktóz-Í,6-difoszfát előállítási eljárást az Osterin-d3éJe adenozm-foszforilezéssel, s ezáltal egy menetben, egyetlen reakcióelegyben termeli az adenozin foszforilezett származékait oly módon, hogy az egyes foszforilezetft adenioein^szárimazékok mennyiségének 5 egymáshoz viszonyított arányát a reakcióelegyben a kívánt ADP-ibermelés irányában tolja el. így a találmány azt is lehetővé teszi, hogy a reakciórendszerben keletkező adenozin-5'-trifoszfátot a sóikkal értékesebb adenozin-ü'-di-10 foszfáttá alakítsuk; át. A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy az olcsón hozzáférhető adenozinból kis oldattérfogatok alkalmazása mellett teszi lehetővé az ADP előállítását. IE Végül az eljárás előnyeként megemlítjük, hogy terméke nem tartalmaz a biológiai és biokémiai felhasználást zavaró szennyezéseket. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 20 1. példa 9-00 g Na2 HP0 4 • 7H2 0-t oldunk 5 1 vízben, majd az így kapott oldatban feloldunk 12 kg 25 glükózt (adagolóoldat). 3,7 1 csapvízben oldunk 400 g glükózt és 600 g szárított sörélesztőt, 30 perc eltelte után 28—30 C°-on hozzáadjuk a fentebbi adagolóoldat nyolcad részét, majd a további nyolcadokat 30—30 percenként. Az utolsó hoz-30 záadás után a reakcióelegyet 30 percen át állni hagyjuk. Az így kapott alapoldat azonnal felhasználható, vagy fagyasztva tárolható. Adenozin-oldat készítéséhez 56 1 csapvízbe 35 240 g KH2 P0 4 -et, 730 g Na 2 HP0 4 • 7H2 0-ot és 700 g adenozint adagolunk, majd 40—45 C°-ra melegítjük a folyadékot, amelyben az adagolt anyagok kissé opálosan oldódnak. 28 kg présnedves sörélesztőt 2,5.1 toluollal el-40 gyúrunk, majd 39 C°-on elfolyósítunk. Az elfolyósodás után még 30 percen át 39 C°-on tartjuk. Ezután hozzáadjuk a fentebbi módon készített adenozin-oldatot, továbbá 9 1 alapoldatot és 420 ml 30%-os vizes acetaldehid-oldatot. Az elegyet 38 C°-on 2 órán át keverjük; ezalatt végbemegy az adenozin foszforilezés. Ezután a reakcióelegybe keverés közben 1000 g szilárd glükózt adagolunk, és a glükóz hozzáadásától számított 4 perc elteltével a pH-t tömény sósavval hirtelen 2-re állítjuk, majd erős hűtés mellett hozzáadunk 50 8 1 50%-os triklórecetsav-oldatot. A szobahőmérsékletre hűtött szuszpenzióhoz 2 kg diatomaföldet (Hyflo super-eel) adunk, és a kapott elegyet centrifugáljuk. A felülúszó pH-ját nátronlúggal 7 és 8 közé állítjuk, majd a felül-55 úszót^vákuumban 40—50 C°-on 1/5 térfogatra bepároljuk, és szűrés után a tiszta oldathoz 4 térfogat metüalkoholt adunk. Az így kapott csapadékot 24 óra állás után dekantáljuk, 80 1 desztillált vízben oldjuk, szűrjük, majd az oldat pH-ját 60 7,5-re állítjuk, és az oldatot anioncserélő gyantával töltött oszlopra vezetjük. Az ioncserélő oszlopról az adenozin-5'-difoszfátot sósav-nátriumklorid eluenssel frakcionáltan es leoldjuk, majd az eluátumból nátriumsó formájá-45
