160109. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lipáz előállítására
leoieo .7 8 rülmányei között ez a magas koncentrációjú piridin a lipázt nem denaturálja. . A lipáz kivonásának ez a módja a korábbiakhoz képest azért is újszerű felismerés, mert a már említett eljárások egybehangzóan a csapadékban levő tannin feloldásán alapulnak: vagy úgy, hogy a tanninnal együtt a fehérjéket és egyéb ballasztanyagokat is feloldják és abból utólag, pl. adszorpcióval választják el az enzimet [Liebigs Annalen der Chemie, 430, 269 (19.23); 6 612 046 sz. holland szabadalmi leírás], vagy kizárólag a tannint oldják ki [Europ. J. Biochem., 6, 425 (1968); 629 416 sz. német szabadalmi leírás]. Ezzel szemben el; árasunk szerint a kicsapószert oldatlan formában hagyjuk és a lipázt visszük oldatba. Így a piridin stabilabb komplexet képez tanninnal, mint a lipáz és ez a piridin-komplex, amely különböző ballasztanyagokat is tartalmaz kötve, pH 5,5—7,5 között mutat legkisebb vízoldékonyságot, de meglepően csak az esetben, ha a közeg vegyhatásának beállítására erős szerves savat vagy ilyennek valamely könnyű fémmel képezett sóját használjuk. •A találmány [tárgya eljárás lipáz enzim előállítására fermentlevekből vagy állati szervkivonatból kicsapás, a csapadék elkülönítései az elkülönített csapadékból az enzim kivonása, majd a kivonatból az enzim kicsapása útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a lipázt tartalmazó vizes oldatból az enzimet pH 6—7,5 között, előnyösen pH 6,3 és 6,8 között 0,4—3,0 súly/tf%-os vizes tannin-oldattal kicsapjuk, a. csapadékot elkülönítjük, majd a lipázt a tannin mellől piridin 0,5—3,0 mólos, előnyösen 0,8—1,5 mólos vizes oldatával pH 5,5 és 7,5 között kivonjuk. Az így nyert oldatból az enzimet célszerűen alkohollal vagy aoetonnal csapjuk ki majd megszárítjuk. • A. találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint az enzim* elkülönítéséhez a tanninos csapadékból, a közeg pH-ját szervetlen savval, előnyösen HCl-val, vagy könynyűfém, pl. -magnézium vagy alumínium erős szervetlen savval -képezett sójával, előnyösen AlCla -al állítjuk be. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a) Az eddig ismert módszereknél egyszerűbben, gyorsabban és gazdaságosabban teszi lehetővé olyan tisztaságú és aktivitású enzim kinyerését, amely, élelmiszeripari vagy gyógyászati célra felhasználható. , b) A baktericíd hatású tannin, továbbá a piridin alkalmazása lehetővé teszi, hogy az emiitett felhasználási területeken megkívánt alacsony csiraszám biztosítható legyen. Az elueiós megoldás ugyanakkor kizárja, hogy a kicsapásra alkalmazott tannin • a végtermékbe - átmenjen, így annak bancerogén hatása biztonsággal kiiktatható, ; c) A kicsapás és az enzimbeoldás körülményei a lipázra nagymértékben fajlagosak. d) A termék fajlagos aktivitása jóval magasabb, mint amit kisózással vagy szerves oldószeres kicsapással el lehet érni. Az ismert módszerek esetén további tisztítási lépések szükségesek ahhoz, hogy az eljárásunkkal kapott termékével azonos tisztaságú terméket nyerjenek. e) A találmány szerinti eljárással fermentléből olyan lipáz állítható elő, mely a jelenleg legmagasabb tisztaságúnak; ismert készítményt — melynek fajlagos aktivitása 18—23 E/mg — felülmúlja. f) A termék szerves oldószerrel könnyen kicsapható és szárítható, vízben tökéletesen oldódik. g) A termék állatkísérletek alapján nem toxikus., h) Áthidalja az ipari enzimgyártás ismert nehézségeit főleg azzal, hogy már a feldolgozás első lépésében jelentős térfogatcsökkenést eredményez; emellett kismennyiségű és olcsó kicsapószert igényel. A térfogatcsökkentést előzetes bepárlás nélkül éri el, ami az energiaigény, valamint a művelet átfutási ideje szempontjából rendkívül előnyös. Ehhez járul, hogy szemben a szerves oldószeres kicsapással, a térfogatcsökkentésnél hűtés nem szükséges és a kivált csapadék jól ülapszik, dekantálható. i) A lipáz enzimekre, eredetüktől függetlenül általánosan ,- alkalmazható. Hatékonyságát a fermentlé összetételének ingadozásai jóval kevésbé befolyásolják, mint a szerves oldószeres kicsapás eredményét. j) A fermentlé vagy szervkivonat aktivitásához képest .25—00% kitermelés elérését teszi lehetővé, és pl. 200—300 E/ml-es fermentléből 20—40 E/mg fajlagos aktivitású lipáz állítható elő. A lipáz-aktívitás meghatározását Desnuelle módszerével [Arch. Biochem Biophys., 83, 309 1959)] végeztük, mely szerint 1 egység (E) az az enzimaktávitás, amely pH 8,0 vegyhatáson és 20 °C-on percenként 1 f*h: zsírsavat tesz szabaddá olívaolajból. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa: 9 liter 270 E/ml aktivitású Bhizopus species szűrt fermentlé vegyhatását pH 6,;5-re állítjuk. Állandó keverés mellett 1 liter 10 súly/tf%-os vizes tannin oldatot adunk a fermentléhez 20— 30 °C hőmérsékleten. Fél óra állás után a kivált csapadékot elkülönítve gyűjtjük. Az így nyert terméket 1,5 liter mólos vizes piridin oldattal felszuszpendáljuk és 0—+5 °C hőmérsékleten keverjük 30 percig. Ezután a szuszpenzió vegyhatását 15 tf%-os sósavval pH 6-ra állítjuk be, 10 15 20 25 S0 25 40 45 50 55 60 4
