160058. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz EC2 előállítására
3 zik azonban az a megfigyelésünk, hogy ha az ammóniumszulfáttal történő kisőzás során az enzimoldat pH-ját 7,5—7,8 tartományban tartottuk, az EC2 frakció nagy tisztaságban vált ki az oldatból. • Eljárásunkat — melynek lényege az Escherichia coli NY/II EC2 termelő mutáns törzs sejtjeinek szénhidrátszegény, zömmel aminosavakat tartalmazó folyékony tápközegben, lúgos tartományban történő tenyésztése L-aszparagináz enzimkomplex termelése céljából — az alábbi példákon szemléltetjük, amely azonban nem tekinthetők korlátozó jellegűnek. Az Escherichia coli mutánst az Országos Közegészségügyi Intézetben 47. szám alatt letétbe helyeztük. 1. példa: 6000 ml csapvízbe 30 g kazein hidrolizátumot (25 mg % N tartalom) és 6 g Na2 HP0 4 -12 H 2 0-t teszünk, majd a táptalajt 10 literes üvegfermentorban 1,2 atü nyomáson 54 percen át sterilizáljuk. A tenyészközeg pH-ja a sterilizálás után 7,0 volt. A táptalaj nem tartalmazott szénhidrátot. A steril, 24 Q C-ra hűtött tenyészlevtít Escherichia coli NY/II sejtek desztillált vizes szuszpenziójával oltottuk be. A sejtek növekedése közben a tenyészlevet 400/perc fordulatszámú lapátkeverővel kevertettük és 0,5 : 1,0 levegő volumen levegő átfúvatással szellőztettük. A mintaként kivett, mosott és ultrahanggal feltárt sejtek tartalmának Sephadex G—50-en végzett oszlopkromatográfiás elemzésekor kitűnt, hogy a növekedés lag fázisban az enzimaktivitási csúcsérték 1—5%-ának, a logaritmikus fázisban a csúcsérték 20—25%-ának megfelelő aktivitásban termelt a mikroorganizmus L-aszparaginázt. A tenyésztés stacioner fázisában a sejtek L-aszparagináz enzimaktivitása megnőtt és az enzimkomplex összetevőinek aránya az EC2 komponens irányába tolódott el, ha a tenyészlé pH-ját 8,5—9,0 érték között tartottuk a tenyésztés során felszabadult ammóniafelesleg kiszellőztetésével. Ez elérhető volt, ha a tenyészlé pH-jának 8,5-re emelésekor a tenyészlébe vitt levegő mennyiségét 2,0:1,0 vol. levegő /tenyészlé térfogat értékre emeltük. A tenyésztést a stacioner fázisban a szárazanyagtartalom konstans értékre és a pH-nak 9,0 értékre való beállásakor megszüntettük, a tenyészlé pH-ját H3 P0 4 -el pH 8,0 értékre állítottuk be, majd 48 g CaCL-t adtunk a tenyészléhez és a keletkezett kalciumfoszfát gélre csapódott sejteket keretes szűrőprésen szűrtük. Az összegyűjtött sejtek szűrőnedves mennyisége 200 g volt. Tíz fermentációból összegyűjtött 2000 g sejtmennyiséghez 2000 ml -f- 4 °C hőmérsékletű desztillált vizet adva a sejteket felszuszpendáltuk. A szuszpenzió pH-ját n NH4 OH adagolással pH 8,5 értékre állítottuk be. A sejtek 4 í'alállományát ultrahang generátor segítségével szétroncsoltuk, majd a sejtek alakos elemeit szupercentrifugán, 12 000 rpm fordulatszámmal 4" 4 °C munkaíhőmérsékleten a szuszpenzió fo-5 lyékony fázisából kiválasztottuk. A kapott oldathoz, melynek térfogata 2000 ml volt, 19,7 g MnCl2 -4-H 2 0-t és 620 g (NH 4 ) 2 S0 4 et adagoltunk és a kivált csapadékot szupercentrifugán 12 000 rpm fordulatszámmal az ol-10 dattól elválasztottuk. A tiszta felülúszóhoz ismételten 744 g (NH4 ) 2 S0 4 -et adagoltunk. Az ammóniumszulfát oldódása során az oldat pH-ját 1 ml NH4 OH adagolásával pH 7.5—7,8 értékre állítottuk. Ez 15 a művelet újabb csapadék leválását eredményezte. A kivált csapadékot -4-4 °C hőmérsékleten anyalúgjátcl szűréssel elválasztottuk. A nedves csapadék mennyisége 120 g volt. A csapadékot 120 ml desztillált vízben szusz-20 pendáltuk, majd azt 20 ml-ként 2000 ml ágytérfogatú Sephadex G—50 fine oszlopon sómentesítettük. Eluáló folyadékként desztillált, vizet alkalmaztunk. A lefolyó eluátum 100—200 ml tartományában az L-aszparagináz EC2 kom-25 ponens sómentes formában volt található. Az eluátumot lioíilizáltuk. A kapott fehérjemenynyiség 200 g volt 20 E/mg L-aszparagináz EC2 aktivitással. A fehérjefrakció 6C3HED egérteszten, BOYSE :;0 és munkatársai [BOYSE. E. A., OLD, L. J., CAMPBELL, H. A., MASHBURN, L. T„ (1961) J. Exptl. Med., 125, 17.] módszere szerint mérve antileukémiás hatásúnak mutatkozott. 35 2. példa: Az Escherichia coli NY/II sejtek szaporítását az alábbi összetételű táptalajban végeztük: 210 gramm kukoricalekvár (50%-os szárazanyag-40 tartalom és 5 mg % N-tartalom) és 12 g Na2HP0 4 -12 H 2 0 6000 ml csapvízben. A táptalaj szénhidrát tartalma 0,01% volt. A táptalaj pH-ját NaOH-val pH 7,2 értékre állítottuk be. A táptalaj pH-ja a sterilizálás után 7,0 volt. 45 A tenyésztést 1 m 3 térfogatú tény észedényben végeztük az 1. példában ismertetett módon. A kitermelés 30 kg/l m3 nedves sejt volt. Az 1. példában említett módon készített kalciumfoszfát gélen szűrt sejteket 70 liter desz-50 tillált vízben szuszpendáltuk, majd 1%, Na-kolát és 1% toluol jelenlétében 37 °C-on 1 órán át dezintegráltuk. A sejttörmelék szűrését keretes szűrőprésen végeztük el. A lefolyó lében a járulékos fehér-5E. jék frakcionált leválasztását, valamint az L-aszparagináz EC2 frakciójának kinyerését az 1. példában leírt módon végeztük. A kapott liofilizált fehérje mennyisége 150 mg volt 20 E/mg aktivitással. 60 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás antileukémiás hatású L-aszparagináz EC2 enzimfehérje mikrobiológiai szintézisei sei történő előállítására és izolálására azzal jel-2
