159839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz dúsítására

159839 5 6 (1967), 721-730, a cikkben további irodalmi utalások), a coli-sejtek pirogénanyagai bekerülnek a végtermékbe. Ugyancsak lehetséges, hogy a feldolgozás közben, amelyet legnagyobbrészt vizes közegben kell végrehajtani, az L-aszparagináz kipreparálásban keletkeznek szennyeződések, amelyek pirogén hatásúak. Sok fáradozás ellenére sem sikerült eddig pirogén-mentes L-aszparaginázt előállítani. A szokásos módszerek a pirogénanyagok eltávolítására, mint a derítőréteges szűrés, a hidroxil-apatittal, alumíniumhidroxiddal, szilikátokkal, továbbá műgyantákkal végrehajtott adszorpciós eljárások nem vezettek eredményre. Campbell szerint az ionizált csoportokat nem tartalmazó dextrán-gélen vagy dietilaminoetil-cellulózon történő kromatografálás is hiábavaló volt. Azt találtuk, hogy a pirogénanyagok az L-aszparagináz preparátumból dietilaminoetil-dextrángél (DEAE dextrángél) segítségével eltávolíthatók, amennyiben az enzimet kis ionerősségű pufferben oldjuk, majd az így kapott oldatot a kromatográfiás módszernek megfelelően duzzasztott és azonos pufferrel kiegyensúlyozott dextrán-gél oszlopra adagoljuk, az L-aszparaginázt emelkedő sókoncentráció mellett frakcionáljuk és kimossuk, vagy pedig az oldatot a batchmódszernek megfelelően dextrán-géllel összekeverjük, a kapott szuszpenziót szűrjük vagy centrifugáljuk, majd a gélhez kötött enzimet alkalmas pufferrel nagyobb sókoncentráció mellett kimossuk. Kromatográfiás eljárás esetén a nyers enzim-preparátumot kb. 0,02 mólos pufferben, előnyösen ammóniumacetát vagy formiát pufferben, közömbös vagy enyhén lúgos tartományban, kb. 7—8,5 pH-érték mellett feloldjuk. A kapott oldat nem lehet túl koncentrált. Előnyösen 1—2%-os enzim oldatot alkalmazunk. A dextrán:

gélt előzőleg ugyanabban a pufferben dizzasztjuk és a puffer többszöri lecserélésével kiegyensúlyozzuk, majd kromatografáló oszlopba töltjük. Az oszlop átmérőjének aránya az ágy-magassághoz képest 13 és 1:30 között lehet. Az enzimoldatot az oszlopra adagoljuk úgy, hogy az átfolyási sebesség oszlop-keresztmetszet négyzetcentiméterenként 2—4 ml/óra legyen. Az eluciót a puffer emelkedő sótartalma mellett hajtjuk végre (a legjobb ha a gradiens lineáris), de lehetséges az is, hogy az eluálószer koncentrációját lépcsőzetesen emeljük. Az enzimet legalább 0,08 mólos acetát ion koncentráció felett eluáljuk. A dúsítást batch-eljárassal is végrehajthatjuk, amikoris az enzimoldatot dizzasztott DEAE-dextrán-gélhez adjuk és a pH-értéket 7,5-re állítjuk be. Az enzimet a gél abszorbeálja és a gél alapos átmosása után nuccs vagy centrifuga segítségével, alkalmas koncentrációjú sóoldattal az enzimet kimossuk. Ennek az eljárásnak az az előnye az oszlopon végzett eljárással szemben, hogy nagy mennyiséggel lehet egyszerűen dolgozni. Hátránya viszont, hogy a kísérőanyagoktól való elválasztás exakt lehetősége kisebb és az elucióhoz nagyobb mennyiségű folyadék szükséges. Az L-aszparagináznak az oldatból szilárd alakban való kinyerése ismert módszerek szerint, pl. kifagyasztással, adott esetben dialízissel vagy polietilénglikolos vagy acetonos kicsapással történik. A találmány szerinti eljárás során 20—100 egység/mg tisztaságú preparátumból kiindulva 180—220 egység/mg protein tartalmú, pirogén kísérőanyagoktól mentes tisztított preparátumot kapunk. Ez a preparátum már alkalmas kemoterápiás felhasználásra. Egy további módszer az L-aszparagináznak piro-5 génanyagoktól való további megtisztítására az alábbi: az enzim-oldatot, amelynek koncentrációja előnyösen 0,5-15%, aminosav, előnyösen glicin jelenlétében, 7,0-9,2 pH-érték tartományban, előnyösen 8—9 közötti pH-érték mellett 40-61 C° hőmérsékletre fel-10 melegítjük, az oldatból a kiváló kísérőanyagokat eltávolítjuk és végül 4,5-5,5 közötti pH-érték mellett polietilénglikolos kicsapást hajtunk végre. A találmány szerinti eljárás során a 0,5—15%-os L-aszparagináz oldathoz aminosavat, előnyösen glicint 15 adunk

1-10%-nyi mennyiségben -10 C° és +65C0 közötti hőmérsékleten. Az oldat pH-iát 8—9 érték közé állítjuk be. Célszerű az oldatot + 50°C hőmérsékleten tartani 1—5 napon át. Ezután az oldatot 5,2 pH értékűre állítjuk be és polietilénglikollal kicsapjuk. Az így kapott anyag dúsított, pirogénmentes, ill. pirogénszegény L-aszparagináz. Ennek az eljárásnak az alábbiak az előnyei: 1. A pirogének az eddig ismert eljárásokhoz viszonyítva megbízhatóbban távolíthatók el; 2. a pirogének eltávolításával egyidejűen az L-aszparagináz enzim specifikus aktivitása jelentősen megnő. ' Egy további, ugyancsak pirogénmentes L-aszparagináz előállítására szolgáló eljárás a glicin stabilizáló hatását használja ki; ezen eljárás során az enzimet aminosav, elsősorban glicin, valamint kis szénatomszámú alifás alkohol, előnyösen metanol jelenlétében, 7,0-9,2 közötti pH-érték mellett 40-61 C° hőmérsékletre melegítjük fel, az oldatból a kiváló kísérőanyagokat eltávolítjuk és végül 4,5-5,5 közötti pH-érték mellett a kicsapást polietilén-glikol oldattal végrehajtjuk. A 4-40%, előnyösen 10% mennyiségben adagolt kis szénatomszámú alifás alkohol, előnyösen metanol az idegen fehérjék további denaturálódását okozza. Ez az eljárás lehetőséget ad az L-aszparagináz nehezen eltávolítható, iners kísérő fehérjéinek eltávolítására, amelyeknek erős antigén hatást tulajdoní-45 tanak. A találmány szerinti eljárás során L-aszparaginázból, amelyet előnyösen polietilénglikollal már 160-220 egység/mg tisztaságúra dúsítottunk, 0,5-15%-os vizes oldatot készítünk. Az oldathoz 10 50 térfogat% metanolt és kb. 3 súly% glicint adunk. A pH értéket 8 és 9 közé állítjuk be. Célszerű az oldatot ezt követően +50 C° hőmérsékleten tartani 1—5 napon át. Ezután az oldatot 5,2 pH értékűre állítjuk be és polietilénglikollal kicsapjuk. Az így kapott 55 anyag dúsított, pirogénmentes, iü. pirogén-szegény L-aszparagináz. A kiindulási anyagként felhasznált, nyers L-aszparaginázt az alábbiak szerint állítjuk elő: 10%-os kukoricalekvárt (szárazanyagra számítva) 2 60 n káliumhidroxiddal pH 7,0 értékűre állítunk be 20 percig 120 C° hőmérsékleten tartjuk, majd lehűtés után ultracentrifugázás segítségével ülepítjük. A tiszta kukoricalekvárból 30 litert 170 liter csapvízzel felhígítunk. 1,20 kg nátriumlaktát és 400 g ammónium-65 szulfát hozzáadása és feloldása után a kapott tápoldatot fermentorban 40 percen át 110 C° hőmérsékleten sterilizáljuk, ezután lehűtjük és 500 cm3

18 órán át