159839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz dúsítására

159839 25 30 C° hőmérsékleten tartott Escherichia coli ATCC 9637 húslevessel készített oltókultúrával beoltjuk. A fermentációs elegyet 30 C° hőmérsékleten 80 liter/ perc mennyiségű levegővel keverés közben levegőztetjük. A keverő fordulatszáma 150/perc. 17 órás 5 tenyésztési idő után a baktériumokat, amelyek az L-aszparaginázt tartalmazzák, ultracentrifugában leválasztjuk, majd 20 liter desztillált vízben ismét szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz keverés közben 80 liter acetont adunk, a csapadék formájában kivált 10 baktériumokat ultracentrifugában leválasztjuk, majd a sejt-tömeget 20 liter desztillált vízben újra szuszpendáljuk. Az L-aszparagináznak a baktériumsejtekből való extrahálása céljából a szuszpenziót 4,5 órán át, 30 C° hőmérsékleten keverjük. Ez idő alatt a 15 pH értéket 1 n nátriumhidroxid-oldat adagolással 7,5—7,8 között tartjuk. Az extrahált baktériumsejtek elválasztása céljából végrehajtott ultracentrifugázás után kb. 17 liter tiszta oldatot kapunk, amelyből 68 liter aceton hozzáadása után az L-aszparagináz más 20 sejtanyagok mellett kiválik. A kapott csapadékot elválasztjuk, acetonnal utána mossuk és 25—30 C° hőmérsékleten vákuumban megszárítjuk. Az így kapott nyers L-aszparagináz enzim-aktivitása 100 egység/mg (30 perces egység). Ez a kiindulási anyag adott esetben az alábbiak szerint dúsítható: 50 g nyers-aszparaginázt, amelynek aktivitása 100 egység/mg, 1000 ml 8,5 pH-értékű trisz-pufferben keverés közben, szobahőmérsékleten feloldunk. Az 30 oldatot 100 ml-es részletekben vízfürdőn 15 percre 59,5 C° hőmérsékletre melegítjük; ekkor bekövetkezik az inaktív fehérjék durva csapadék formájában való kiválása, míg az enzim változatlanul oldatban marad. A denaturált elegyeket egyesítjük, lehűtjük és 35 6000/perc fordulatszám mellett lecentrifugázzuk. Az oldat 200—300 egység/mg protein specifikus aktivitású. Ezt az oldatot a továbbiakban A oldatnak fogjuk nevezni. Az enzimek ismert oldószeres frakcionálásának megfelelően (v.ö.Biochem, J.48j 42-48 40 (1951) az A oldat acetonnal frakcionálható, ekkor az L-aszparagináz, az oldat 30-50%-os acetonkoncentrációjánál képződő csapadékba kerül. Ezzel a módszerrel kb. 500 egység/mg tisztaságú peraparátumot állíthatunk elő. 45 A találmány szerinti eljárás során akár kb. 100 egység/mg tisztaságú nyers aszparaginázból, akár dúsított preparátumból kiindulhatunk. Különösen célszerű kiindulási anyag a polietilénglikolos frakcioná- 50 láshoz maga az A oldat, vagy az abból acetonos frakcionálással nyerhető L-aszparagináz. A frakcionálással elérhető dúsítási határ nem állandó, mert az a szennyeződések milyenségétől függ. De ez a határérték egy egyszerű előkísérlettel megállapítható. 55 Példák a polialkilénglikolos kicsapásra: 50%-os polietilénglikol-oldattal keverve további csapadék képződik, amelyet kinyerünk. Ez a csapadék a 2. frakció. A 2. frakció fölötti oldatot (1550 ml) ismét 100 ml 50%-os polietilénglikol oldattal keverjük és a csapadékot ismét kinyerjük. Ez a 3. frakció. Azonos módon eljárva kapjuk a 4. frakciót. Az ezen frakcionálás során elért tisztasági fokozatokat és kitermelési adatokat az alábbi táblázat tartalmazza: Frakció-Kitermelés Egység/mg %-os egységszam g tartalom a kiindulási nyers aszparaginázra számolva 1 1,46 230 6 2 2,43 1050 43 3 1,40 1240 29 4 0,64 310 4 2. példa 100 g 103 egység/mg tisztaságú nyers aszparaginázt 2 liter vízben feloldunk és centrifugálással tisztítjuk. Az oldatot 1 n KOH-oldattal 8,5 pH értékűre állítjuk be és az 1. példával azonos módon polietilénglflcol oldattal frakcionáljuk. A kapott 2. és 3. frakciót egyesítjük. A kitermelés 12,0 g. Egység/mg 765 Kitermelés a kiindulási elméleti 88%-a. egységekre számolva: az 3. példa A 2. példa szerint kapott, a 2. és 3. frakció egyesítésével előállított üledéket 400 ml vízben feloldjuk és ismételten polietilénglikol oldattal végzett frakcionálásnak vetjük alá. A 2. és 3. frakcióként kapott üledéket kétszer szárított és mélyhűtött acetonban diszpergáljuk, centrifugáljuk, vízben feloldjuk, Seitz-K3 rétegen szűrjük és liofilizáljuk. Kitermelés: 4,40 g Egység/mg: 1730 . Kitermelés 100 g nyers aszparaginázra számolva: 74%. 1. példa 1000 ml A oldatot (amelyet 50 g 112 egység/mg aktivitású nyers L-aszparaginázból állítunk elő) 3 C hőmérsékletűre lehűlünk és 500 ml 50%-os polietilénglikol oldattal keverünk össze. Az üledéket centrifugálással nyerjük ki. A kivált L-aszparaginázt 1. frakciónak nevezzük. Az 1. frakció fölötti oldatot (1468 ml) 100 ml 60 4. példa 5,0 g L-aszparaginázt, amelyet az A oldatból acetonos frakcionálással 576 egység/mg-ra dúsítottunk, 100 ml vízben oldunk és polietilénglikol-65 oldattal az 1. példában leírt módon frakcionálunk. Ezen frakcionálás során elért tisztasági fokozatokat és kitermelési adatokat az alábbi táblázat tartalmazza: 4