159720. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 204 és A 204 II antibiotikumok előállítására és ilyen hatóanyagot tartalmazó kártevőirtószerek

159720 8 Az A204 antibiotikum tenyésztésénél alkalmazott tenyészközeg tetszés szerinti lehet, mivel a fenti hasznosítási vizsgálatokból kiderül az, hogy a mikroorganizmus különböző energiaforrások hasznosítására képes. Az antibioti- s kum termelés gazdaságossága, a maximális antibiotikum hozam és az antibiotikum izolálásának megkönnyítése céljából azonban célszerűen viszonylag egyszerű tenyészforrásokat alkalmazunk. Így pl. antibiotikum termelésére alkalmas j0 közeg szénforrásként glukózt, fruktózt, keményítőt, glicerint, melaszt, dextrint, barnacukrot és hasonlókat tartamaz. Az előnyös szénforrás a glukóz. A tenyészközeg járulékosan asszimilálható nitrogénforrást is tartalmaz, ilyen pl. 15 szójaba'bliszt, kukoricalekvár, élesztő, gyapotmagliszt, húslé, peptonok (hús vagy szója), kazein, aminosavkeverékek és hasonló anyagok. Nitrogénforrásként a peptonok, szójababliszt, aminosavkeverékek és hasonlók használata elő- 2

o nyös. A tenyészközegbe tápanyagként szolgáló szervetlen sóként a hagyományosan használt sók, így a nátrium, kálium, ammónium, kalcium, foszfát, szulfát, klorid, karbonát és hasonló ionok képzésére alkalmas sók keverd 2

5 hetők be. Az A204 antibiotikum termelésénél az optimális növekedés és a mikroorganizmus fejlődése szempontjából szükséges nyomelemeket is juttatunk a tenyészközegbe. A nyomelemek rend- 30 szerint a tenyészközeg egyéb komponenseibe szennyezésként vannak jelen olyan mennyiségben, amely a jelen találmány szerint előállítani kívánt Actinomyeeták fejlődéséhez elegendő. 35 A tenyészközeg kezdeti pH-értéke változtatható. Azt tapasztaltuk azonban, hogy előnyös, ha a közeg kezdeti pH-érteke 6,5 és 7,5 között van. A többi Actinomyceshez hasonlóan a közeg pH-értéke fokozatosan növekszik a mikro- .. organizmus növekedési periódusában az antibiotikum termelése közben és 7,0—7,6 pH szintet érhet el; természetesen a végső pH-érték részében a közeg kezdeti pH-értékétől, részben a közegben jelenlevő pufferanyagoktól és a tenyészidőtől is függ. . 45 50 55 Az A204 antibiotikum termelésére süllyesztett, levegőztetett tenyészközegéket választunk. Viszonylag kismennyiségű antibiotikum termelésére rázólombikokban és palackokban felületi tenyészeteket is alkalmazhatunk, nagyobb mennyiségben való termelésre azonban steril tartályokban süllyesztett, levegőztetett tenyészetet részesítünk előnyben. A steril tartályban levő tenyészetet spóratartalmú szuszpenzióval beoltjuk, mivel azonban a spóratartalmú szuszpenziókkal történő beoltásnál lappangó növekedési fázist (lag periódus) tapasztaltunk, a tenyészet vegetatív alakját részesítjük előnyben. A lappangó fázis kiküszöbölése folytán a 60 fermentációs berendezés jobb kihasználhatósága érhető el. Ennek megfelelően az első lépésben tehát a mikroorganizmus vegetatív fázisban levő oltóanyagát állítjuk elő oly módon, hogy 65 viszonylag kismennyiségű tenyészközeget beoltunk a spóra alakú szuszpenzióval, majd amikor már fiatal, aktív, vegetatív tenyészethez jutunk, ezt a vegetatív fejlődési stádiumban levő oltóanyagot visszük be aszeptikus körülmények között a fermentorha. A vegetatív fejlődési stádiumban levő tenyészet közege megegyezhet az A204 antibiotikum nagyüzemi termelésére használt közeggel, esetleg attól eltérő összetételű. Az A204 antibiotikumot termelő mikroorganizmus viszonylag tág, 25—32 C°-ig terjedő hőmérsékleti tartományiban tenyészthető. Az A204 optimális fejlődése 26—36 C° között van. Általában az antibiotikum maximális termelése á tenyészközeg beoltása után 48—72 óra elteltével következik be. A levegőztetett, süllyesztett tenyészeteknél szokásos módon a tenyészközegen steril levegőt fúvatunk át. A mikroorganizmus hatékony fejlődése és az A204 antibiotikum termelése szempontjából a felhasznált levegő térfogata az; A204 tartályokban való termeilésénéi 0,2—0,4 térfogat levegő/perc/térfogat-tenyészet. Az előnyös levegőztetési arány 0,35 térfogat levegő/perc/térfogat-tenyészközeg. Az antibiotikum hatékony koncentrációja a tenyészközegben a fermentációs periódus közben könnyen meghatározható oly módon, hogy a tenyészközegből mintákat veszünk, és a minták inhibitor-koncentrációját meghatározzuk, olyan mikroorganizmusok tenyészetében, amelyek ismeretes módon az A204 antibiotikum jelenlétében növekedésben gátoltak. Erre a célra a Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Bacillus subtilis és Mycobacterium avium .alkalmasak. A minták vizsgálata a jólismert zavaró sságméréssel vagy lemezes módszerrel történhet. Az A204 maximális termelése a tenyészközeg beoltása után 2—3 napon belül bekövetkezik, mind süllyesztetett, levegőztetett tenyészetékben, mind rázott kultúrákban. Az A204 antibiotikum fermentációja közben kifejtett antibiotikus hatékonyság mind az antibiotikum oldatában, mind a micéliumban, vagy mind a két anyagban meghatározható. Ennek megfelelően az A204 antibiotikum termelésénél izoláilási technika szempontjából mindkét forrás megfelel. A fermentlevet például szűrjük és a szűrletet megfelelő oldószerrel extraháljuk, ilymódon a micéliumban hiányzó antibiotikum visszanyerhető. Ezenkívül a micéliumban jelenlevő antibiotikumot szintén megfelelő oldószerrel kimerítően extraháljuk. Mindkét extraktumból az antibiotikum a szokásos módon kinyerhető. A kristályos A204 antibiotikumban kémiai és fizikai elemzése alapján 4—5 metoxicsoport jelenléte kimutatható. Az A204 antibiotikum Whatmann No. 1. papíron történő papírkromatográfiás analízisénél a következő R/ értékeket kapjuk: R/==0,14 4