159347. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hasnyálmirigyek extrahálására
3 159347 4 8 körüli értékre állították be, amiikor inaktív fehérjékből, és finoman eloszlatott sejtmamadványokból álló, voluminózus csapadék vált ki A kivált csapadékot 'szűrést elősegítő anyag jelenlétében végzett szűréssel különítették el. A 8-as pH-in végzendő műveleteket a lehető leggyorsabban kell végrehajtatni egyrészt azért, hogy megakadályozzuk az enzitaHmaradékok és az inzulin kedvezőtlen körülmények között fellépő kölosönhatjását, másrészt azért, hogy a kivonatban és a csapadékban jelenlevő, aiktív tioü-osoportok és az inzulin között 8-as pH-n fellépő redukciót a lehető legnagyobb mértékben visszaszorítsuk. Ismeretes, hogy a szűrés idejét a csapadék szűrhetősége határozza meg. Ebben az esetben a szűrés idejét a 'kivonat oentrifugálhatósága is befolyásolja, ugyanis a kivonat centrifugáihatóságától függően változik a 8-as pH-n leváló csapadék szűnhetősége. A kapott átlátszó szűrletet a lehető legrövidebb időn belül pH = ß-tra savanyítják, majd 10 15 20 vákuumban térfogatának kb. 1/5-^ére bepárolják. A maradékból eltávolítják a zsírt, majd a maradékot szűrik, és a szűnletben levő fehérjét 100 liter szűrletenként 28 kg nátriumklorid hozzáadásával kicsapják. A javítatt hasnyállmirigy-extralhálási eljárás kidolgozásakor ügyelni kell arra, hogy az új eljárással kivonható fehérje mennyisége ne csökkenjen lényegesen., azt tapasztaltuk ugyan^ is, hogy a kivont fehérjemannyiiség lényeges csökkenése az inzulinniennyiség csökkenésével jár együtt. A fentiek figyelembevételével megvizsgáltuk néhány sav föhérjekivonó képességét az ismertetett eljárás isoráln. Sertés hasnyálmirigyet 2 térfogatrész 81°/<ros etanollal 90 percig 8 C°-on extraháltunk. A reakcióelegy alkoholtartalma 60 térfj%- IÁ kivonatot 10 percig 4000 Gnn oantrifugáltuk. Az elegyet 28P/0 os, majd 10%-os sóoldattal kisóztuk,, majd biruet-reakciójával meghatároztuk az egyes kísérletekben kapott fehérje mennyiségét. A kapott eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze. 1. táblázat Sav H3PO4 HCIO. H2 S0 4 HCl Extrákció pH-ja Csapadék térfogata a nyers kivonat %-ába.n Biuret reakcióval meghatározott fehérjemennyiség (1 kg hasnyálmirigyre) Biuret reakcióval meghatározott fehérjeniennydség a sósavais extraktum fehérjebartaiirnának %-áhan 2,8 24,5 47,17 74 2,0 2,0 2,0 nem szűnhető 1.2,5 31,6 23,40 37 63,55 100 A táblázat adataiból megalapítható, .hogy a legnagyobb mennyiségű fehérje sósavas etanollal -vonható ki. Ebben az esetben azonban 45 igen nagy térfogatú csapadékot kell kiszűrni, így a szűrés, hosszú időt vesz igénybe. Megállapítható továbbá, hogy alkoholos kénsavoldat felhasználásakor az előzőnél sokkal könnyebben feldolgozható kivonat képződik, ezzel az 50 anyaggal! azonban csak kevés fehérje vonható ki. Eljárást dolgoztunk ki inzulin kivonására hasnyálmirigyekből az inzulint oldó, megsava- 55 nyitott oldószerrel, amelynek során a hasnyálmirigyet első lépésben kénsawal megsavanyított oldószerrel extrahá'ljuk, majd az elegyhez sósavat adunk, és folytatjuk a hasnyálmirigy extrahálását. így igen jól centrifugálható ex- go traíkciós elegyet kapunk, és a kívánatból 8-as pH-n leváló csapadék igen rövid idő alatt kiszűrhető. Ezzel az eljárással lényegében ugyanannyi fehérjét tudunk kivonni, mint ha az extrakciót sósavval, megsavanyított • rövidszén- 65 láncú alifás alkoholokkal végezzük. Az inzulin kivonásához a legcélszerűbb szerves oldószernek az, etanol bizonyult. Az extrtakeiót báírmilyen forrásból származó hasnyálmiriggyel végrehajthatjuk, így pl. szarvasmarha-, sertés-, bálna- vagy hal-Jiasnyálmirigyet heszmálhaitunk fel. Már akkor is megfelelő eredményt érünk el, ha az extoakciós elegy pH-ját kénsawal 5,2-re állítjuk be, az elegyet 15 percig jnkubáljuik, majd az elegyhez sósavat adunk, és az extrakciót további 60 percen át folytatjuk. Ezzel az eljárással a szűrési idő a csak sósavat tartalmazó oldattal végzett extrákció szűrési idejéhez képest a felére csökken. Ha első lépésben :60 percig sósavas oldattal végezzük az extrakciót, és ezután adunk kénsavat az elegyhez, a fentivel lázonos teljes exteakciós idő esetén az elegy feldolgozhatósága nem javul. A kénsavas extrakcióft előnyösen 2,4—5,2 közötti pH-értéken végezzük. Ha a kénsavas extrakciót 3,0-as pH-jú közeggel hajtjuk ivégre, egyébként pedig a fentiek szerint dolgozunk, ?
