158957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pirrolidinkarboxamido-D-galakto-oktopiranozid-tipusú antibiotikumok (linkomicin, celeszticetin) 3-foszfátésztereinek

158957 6 hatjuk, amíg a hozzáadott nem foszforilezett vegyület kívánt foszforileződése a fermentációs cMusban már nem lehetséges. A nem foszforüezetit vegyület adagolási idejét és az adagolt mennyiséget könnyen meghatároznatjuk bármely fermentációra nézve oly módon, hogy nem foszforiliezett vegyületet adunk hozzá, ameddig egy 'bizonyos toxicitást észlelünk, ami a foszfotriüezés gátlójaként jelentkezik. Amenynyiiben a fermentációs ciklus végén nem foszforilezett vegyület maradna vissza, akkor kevesebb nem foszforilezeitt vegyületet kell használni és/vagy a hozzáadagolási időt kell megváltoztatni. Egy másik eljárás a linlkomicinnek, vagy analóg származékainak vagy celeszticetinnek foszforilezésére abból áll, hogy a foszforilezendő vegyületet infculbáljuk egy Streptarnyees tenyészet sejtmentes kivonatával, amely a szükséges foszforilező enzimet tartalmazza. A sejtmentes kivonatot 24 órás Streptomyces kultúrából készíthetjük. Az inlkuibálást 26—32 C° hőmérsékleten végezzük. Az inkuíbálás idieje a fo&zforilezendő vegyület mennyislégével változik, így például 24 óránál rövidebb inkubációs idő elegendő 50 y/ml linkomícinnek lincomiein-3Hfioszfáttá történő foszforilezésére. Ha a fentiekben meghatározott vegyületek foszforilezésére sejtmentes Streptomyces-kultúra kivonatot használunk, úgy a hozzáadagolható nem foszfoiriiezett vegyület mennyisége a tenyészet-kivonatnak a hozzáadott vegyületre számított fosztfoirilező kapacitásától fog függeni. Ez a szint könnyen meghatározható oly módon, hogy a tenyészet-kivonatlhoz fokozatosan több és több nem foszforilezett vegyületet adunk mindaddig, amíg nyilvánvalóvá válóik, hogy a hozzáadott nem foszforilezett vegyület miár nem íoszforileződik. Minthogy a nem foszforilezett vegyület baktériumellenes aktivitását in vftro elvesizti a molekula 3-(helyzetben történő foszforilezéséttél, az in vitro észlelt baktériumellenes aktivitás agy tenyésizeWkivonatban 24 órával a nem foszforilezett vegyület hozzáadása után nyilvánvalóan azt jelenti, hogy a tenyészet-kivonatnak a nem foszforilezett vegyület foszforilezésére irányuló kapacitását már túlléptük. Az előbbiekben említett in •vitro baktériumellenes aktivitást a Sarcina lutea mikroorganizmussal szemben lefolytatott szabványos mikrobiológiai lemezkísérléttel határozhatjuk ímeg. A jelen találmány tárgyát képező új vegyületek eülkülönítésérie és tisztítására sokféle eljárást alkalmazhatunk, így például oldószeres kivonatolást, folyadák^f'olyadők megosztásit Graig-készülékben, folyadékfázisú ioncserés extrakciót, adszorpciót valamilyen alkalmas adszorbensen, pl. szénen és oszlopkromatográfiát. Egy előnyös kinyerési eljárás során az új foszforilezett vegyületeket a fermentlétől vagy az előbbiekben leírt sejtmentes kivonatrendszertől szűréssel elkülönítjük, a szűredéket azután átvezetjük egy alkalmas adszorlbensan, pl. aktív szénen vagy Amiberlite XAD—2—m (a Rohm and Haas Co. cég által árusított gyanta) a vízben oldható szennyezések eltávolítására, me-5 lyek zavarhatják a következő kiromatográlfiás lépést. A szénről vagy az Ambarliite XAD—2 gyantáról kapott eluátumot ezután átvezetjük egy kromatográfiás oszlopon, amely anioncserélő gyantát, pl. aoetáit formában levő Dowex-1 10 (X—4)-et (a Dowex Qhemliual Oo., Midland, Michigan által árusított gyantaféleség) tartalmaz. A kromatográfiás oszlopról frakciókat fogunk fel és ezeket az S. lutea mikroorganizmus elleni aktivitásúkra nézve megvizsgáljuk — al-15 kálikus íoszfatázzal való kezelés előtt és után —, ahogyan azt a későbbiekben leírjuk. Az alkalikus foszfatáz-tesztnél a S. lúteával szemben legnagyobb aktivitással rendelkező frakciókat összeöntjük, betöményítjük, majd Craig-20 készülékben ellenáramú magosztásnak vetjük alá, n-ibutanol-viz (1 : 1 v/v) oldószerrendszer használva. A linko'mMn-^nfoszfát és a linkomíein 3-25 ^foszfátjai in vitro lényegében véve inaktívak baktériumokkal szemben. Ennélfogva ezeket az új foszfátvagyületekét in viitno reakcióélagyekben — ahogy azt a fentiekben leírtuk —, vagy más elegyefcben, amelyek 3-foszfátvegyületefcet 3ű tartalmaznak, alkalikus foszfatázzal végzett hidrolízis útján mutatjuk ki. Így például a realkcióelegy a linkomiein-3~foszfát alkalikus foszfatázzal váló hidrolíziséhez a következőkből áll: 0,5 ml triisz-puffer (0,5 mólos, pH = 8,0), 35 0,6 ml alkalikus foszfatáz (1 mg/ml) 0,5 mólos trísz-ipuftferbcn (pH = 8,0) készítve, 0,05 ml (50. meg) linkomaein-3-ifoszifát. Ezt a reafccióelegyét egy éjjelen át 2:8 C°-on inkubáljuk. A fos:ztfatáz eltávolítja a 3-tfoszfátesoportot és a 40 linkomicin vegyület ezután baktériumellenes aktivitást mutet in vitro. A találmány szerinti új vegyületek előállításánál használható Streptomyoes fajták példái 45 az alábbiak: S. rocihei, NRRL 3512; S. vendargensis, NRRL 3:530; S. coeliootor 1945, NRRL 3531; S. ooelioolor Müller, NRRL 3532; Actinomyces' (Streptomyoes) eylindrosporus 3166 CICM, NRRL 3535; Actinomyces. (Streptomyoes) 50 cyaneatfuseatus, NRRL 3534; S. rochei, NRRL 3535; és S. armenitosus, NRRL 3176. Ezek a kultúrák korlátozás nélkül beszerezhetők a következő címen: Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, 55 U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illionis, U.S.A. Azt találtuk, hogy a klinlimicin sértetlen sejteket tartalmazó rendszeriben sokkal könnyebben foszforiieehető a linkomiiciníhez vagy egyéib 60 linlkomiícin- és .klmiimiain-tainalógoklhoz, mint pl. l'-deinetlilkliniimiciinihe.z és l'^dametiil-<4'-pentiil-Miinimiicinhez képest. Ha valamely Streptomyces-kultúna sejtmentes, -kivonatát alkalmazzuk, úgy a találmány szerinti összes kiindulóvegyü-65 let egyformán könnyen fosziforilezihétő. 3