158918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kortikoszteroidok mikrobiológiai C-1,2-dehidrogénezése hatásfokának javítására
158918 8 Ha az átalakítást 'nagyobb, 0,8—1,0 rag/ml feletti szteroid-koncentrációval folytatjuk le, akkor a fenlüeken túlmenően még gondoskodni kell arról is, hogy fizikai folyaimattok nie akadályozzák "az eljárás szerjnt előállított magas aktivitású tenyészet 1,2-dehidrogénezését, A szuszpenzióban adagolt, vagy az oldószeres adagolás után a vizes közegben káváit átalakítandó szteroid ugyainis a keleíJkező és az oldhatósági érték •felett a remdszerhol kiváló termékkel elegykriistályi képieizihelt, az így kikristályosodott anyag a biológiai rendszerből kiválva az enzim számára a továbbiakban hozzáférhetetlenné válik. A nagy aktivitású, és esetleg ihidogénaikceptort is tartaíknazó hígított itenyésze-fchez azért az átalakítandó szjteroidat célszerű több adagban, vagy folyamatosan olyan sebességgel adagolni, hogy a még átalakítailan szteroidnak ia koncentrációja, az átalakítási közegben az .eljárás folyamán ne növekedjék az oldhatósági haltár fölé. Hidrokortizon esetében ez a batár 0,3—0,5 mig/rril. Minthogy a találmány szerinti módon történő indukció scran az enzim még az átalakítás megkezdése előtt kialakul, az átalakítás lelőtt mért enzim-aktivitásból, vagy az átalakítás első órái-0 óra elteltével óra elteltével óra elteltével óra elteltével óra elteltével óra elteltével 6 óra elítéltével 3,5 17 40 68 93 107 112 ban mért átalakítási sebességből a folyamatos adagolás kívánt sebessége pontosan kiszámítható. Az eljárásit az alábbi példákban szemléltetjük siterilezett, 0,3% ammániumíszukciná-10 15 20 25 1. példa 5 liter tot, 0,6% glükózt és 0,1% pékélösiatő't, 0,1% káliumdiíhidrofoszfátot tartalmazó, 6,8—7,0 pH értékű táptalajt beoltunk Coryinelbacterium fascians szuszpenzióval, majd a baktériumokat 30—35 C° között, keverés és tavegőzltieités mellett eiddíig tenyésztjük, míg ,a táptalaj glükóz-tartalma teljesen feihaszinálódik. Ekkor 0,5 liter steríil, 0,8% amimóniumszuktíiínáitot tartalmazó oldatot és 0,2 mg ml végkoncentrációt biztosító 1,1 g hidrokortizJont adunik 70 ml acetonnal készített oldat alakjában a tenyészethez és az i'nkubálást még 6 óra hosszat folytatjuk. Az indüktorkéínít adagolt hidrokortizon 0,7—0,9 mg/m] koncentrációig a tenyészet növekedését nem gátolja, az indukció ideje alatt a tenyészet sejtszáma kb. 20%-kal nő. A tenyésizeit sízteroid-C-l,2-dehid:rogenáz aktivitását diklórfenolJindofeaiol módszerrel óránként meghatározva a következő értékeket kapjuk DFIF egység 4,4.10 "> DFIF egység/4,4.1010 DFIF egység/4,4.1010 DFIF egység'4,4.1010 DFIF egység'4,4.1010 DFIF egység/4,4.10i0 DFIF egység/4,4.1010 baktérium baktérium baktérium baktérium baktérium baktérium baktérium Ha ugyanezt a tenyészetet csak 0,:2 mg/ml hidrokortizon induktor adagolásával 2 órán át indukáljuk, az elért aktivitás 18 egység'4,4.101 ' 1 baktérium. 2. példa 750 ml-es Erlenmayer lombikban sterilizált 200 iml térfogatú táptalajt, amiely 0,2% hiaztidint, 0,5% glükózt, 0,05% élesztőkivonatot. 0,25% káliumdihidrofoszfáítot és 0,25% magnéziumsziuítfátot tartalmaz (pH = 6,9—7,0), Corynebac'terium simplex tenyészetéivel beoltunk és 30—35 C°-on rázóaaztalon addig folytatjuk >a tenyésztést, míg a 3X1010 baktérium/tml értéknél elérjük ;a stacioner fázist. Ekkor 30 ml steril 0,1%-os vizeis hisztidim oldatot aduink a tenyészeteikhez és a kívánt enzimet 1,0 'ml metanolban oldott 20 mg prednizolon hozzáadásával indukáljuk. 4 órai indukció után a tenyészetet 4800 ml sterilizált vízizél 'hígítjuk, majd 30 ml (10% CaCÍ2-ot tartalmazó) cmieitainoliban oldott 3 g hidrokoritizont adunk hozzá és levegőztetés mellett 30—35 C°-on megindítjuk ia dehidrogéniezést. Az átalakítás 4., 6., 8., 10. és 12. órájában még további 1—1 g hidrokoriizont adunk 10—10 ML CaCl^-os metanolban oildiva a fermentációs közeghez. 16 órai átalakítás u\tán 3X2000 ml acetáttal extraháltuk a szteroidokat a farimenitlébőil, jaz egyesített etilacetátos. fázist vízmentesítjük, bepároljuk és a száraz maradékot kevés 40 45 50 55 60 65 etilaicetátbói átkrisitályoBÍtjíuk. A kapott prednizoloniban az áíalakulatlan hidrokortizon menynyisége 1,2%. 3. példa 150 liter sterilizált, 0,1% aszparagint, 0,5% glükózt, 0,2% kukoricalekvárt (szárazanyagtartalom 60%) tartalmazó, 6,8—7,0 pH-értékű táptalajt beoltunk Coryne-bactérium simplex tenyészetével és a tenyésiztést 30—35 C°-on keverés és levegőztetés mellett a táptalaj glükóztartalmának elfogyásáig folytatjuk. Ennek elérésekor a tenyészethez 30 liter 0,5% glükózt és 0,2% aszparagint tartalmazó steril vizet, valamint induktorként 360 ml CaCl2-os metanolban oldott 36 g hidrokortizionít aduink. Az idkuíbálást 4 óra hosszat tovább folytatjuk, ekkor 200 ml metanolban oldott 8 g 2-metil-l,4-!naftoíkinonit adunk a tenyészethez, majd 20 liter vízben szuszpendá'lit 5000 g hidrokortizo'n adagolását kezdjük meg a keverés és levegőztetés továbbfolytatásia mellett. 72 g hidrokortizon (300 ml szuszpenzió) egyszeri beadása után 5 percemként tmiintái veszünk és kénsavas kromogén-méirésem alapuló módszerrel mérjük a prednizolon keletkezésének sebességét. A prednizolon-keletkezés, azaz a dehidrogénezés sebességét 420 g/órálban határozva meg, a. szuszpenzió adagolási sebességét 250— 300 g hidrokortiiZon/óirárH állítjuk be. Az ada-4
