158809. lajstromszámú szabadalom • Eljárás krisztályos B12 koenzim és B12 vitamin gyártására
158809 í) Az első négy oszlopról — melyeken az összes megkötött korrinoidok 87%-a található — nyert összesített eluátumban (A) az eredeti faktor-tartalomnak kb. egyharmad része marad. Az eluátum (A) összes korrinoidkoenzim tartalma 1107,5 mg, összetétele 96,65% Bi2 koenzim, 3,35% kísérő korrinoid-koenzim faktor. Az összesített eluátumot vákuumban, 35 C°-on 50 ml-re bepároljuk. Ezután megszűrjük és aceton hozzáadásával kikristályosítjuk. A kristályosítást 300 ml absz. acetonnal végezzük, melyet 100 ml/60 perc sebességgel adagolunk. 24 óra eltelte után a kivált kristályokat szűrjük. A termék 930 mg kristályos Bi2 koenzim, mely 820 mg kristályvízmentes hatóanyagnak felel meg. A kristályanyalúgot, mely 162,5 mg korrinoidkoenzimet tartalmaz és összetétele 84,3% B12 koenzim. és 15,7% koenzim faktor, egyesítjük az 5—8 oszlopról kapott elutátummal (B), mely 110,4 korrinoidkoenzimet tartalmaz 66,3% B12 koenzim és 33,7% koenzim faktor megoszlásban. Az egyesített oldatokat a következőként dolgozzuk íel: Az egyesített, kb.; 60% aceton tartalmú oldathoz 50 mg nátriumcianidot adagolunk és fény jelenlétében 1 órán át kevertetjük. A 272,9 mg korrinoidkoenzim tartalom eközben cianokobalaminná illetőleg cianofaktorrá alakul, összesen 234 mg Bj2 vitamin értékben kifejezett cianokorrinoidot kapunk. Az oldószert vákuumbepárlással lehajtjuk. A vizes oldatot, melynek térfogata 15C ml, kétszer 15 ml fenol-széntetraklorid eleggyel extraháljuk, majd Brockman-féle alumíniumoxid oszlopon kromatograf áljuk. A kromatogram kifejlesztését vizes acetonnal végezzük. A főfrakcióból absz. aceton hozzáadagolásával 170 mg B12 vitamin kristályt kapunk, mely 170 mg kristály vízmentes B12 koenzimnek felel meg. , Az össztermelés 990 mg hatóanyag, a kiindulási 1225 mg-ra vonatkoztatva a kitermelés 81%. A koenzim és faktor koncentrációjának mérését (össz-korrionid-tartalom) stabil Bj.2 vitaminként azaz ciano-formában végeztük el. Az oldat 361 nm-en, mint jellemző maximumnál történő elnyelését mértük és E (1%, 1 cm) — 207 specifikus extinkcióval számoltuk. (British Pharmacopeia 1968., 262. old.) A kapott értéket a mólsúlycsökkenés miatt 1,14-es szorzóval számítjuk át koenzim-formára. A korrinoidok ,százalékos megoszlását papírkromatográfiás módszerrel mértük. • Macherey Negel No. 214 típusú papírt használva az egyes mintákat a startvonalra felcseppentettük. Felszálló technikát alkalmaztunk a következő futta tóeleggyel: szekunder butanol: víz=100: 50; mind a felcseppentést, mind a futtatást fény kizárásával végeztük. A kromatogramok 16 óra alatt kifejlődtek. Az alkalmazott B12 koenzim kontrollnak megfelelő foltot és a kísérő faktor foltokat külön a papír megszárítá-10 Í0 40 45 60 sa után kivágtuk és 1%-os nátriumcianid oldattal eluáltuk, az oldatok koncentrációját 361 nmnél az előbbi módon meghatároztuk, így a százalékos megoszlás a két oldatból számítható. 2. Az 1. példa szerint járunk el a feltárás végéig. A feltárt léből 25 l-t ismételten elvéve az ott leírtak szerint tisztítjuk a feltárt oldatot és a közölt paramétereknek megfelelő adszorpciós technológiát alkalmazzuk. A 8 sorbakötött oszlopon az alábbi megoszlást találjuk. zes Korri- %-os összetétel Oszlop nőid- Meg" Szám koenzim B12 koenzirr kísérő korr. •,€ ® r ~ mg 20 1—4 1082 96,14 3,86 A 5—8 120,5 65,40 34,60 B elfolyó oldat 50 kb. 100 Az 1—4 oszlopról nyert eluátumhoz (A) 250 mg nátriumcianidot adagolunk, majd fény jelenlétében 1 órán keresztül kevertetjük, ezalatt a konverzió végbemegy. Vákuumdesztillációval 35 C°-on 100 ml-re töményítjük, absz. aceton hozzáadásával Brockman-féle alumíniumoxidra csapjuk. Az alumíniumoxidról 50%-os acetonnal leoldva, absz. acetonnal kristályosítunk: A kapott kristály mennyisége 880 mg B12 vitamin. Az 5—8 oszlopról nyert eluátumot oldószermentesítjük (B), majd a következő megkötendő alikvothoz keverjük (lásd a 3. sz. példát). 3. Az 1. példa szerint járunk el a feltárás végéig. A feltárt léből 25 l-t ismételten elvéve az 1. példában leírtak szerint tisztítottuk a feltárt oldatot. Eredményül 30,5 1 összesen 1270 tng korrinoidkoenzim tartalmú oldatot kapunk; összetétele 89,4% B12 koenzim és 10,6% kísérő korrinoid-koenzim faktor. Ezzel egyesítjük a 2. példa (B) eluátumát. Az adszorbeálandó oldat öszszetétele 1390,5 mg korrinoidkoenzim, melyből 87,4% B12 koenzim és 12,6% kísérő korrinoid. Az adszorpciót és az 1—4. oszlop eluálását az 1. példa szerint végezzük, az 5—8. oszlopot nem eluáljuk. A koncentráció és összetételváltozás következtében a megkötésnél az oszlopokon a B12 koenzim és a kísérő korrinoidok aránya nem változik, csupán az elfolyó oldatban kísérő faktorok koncentrációja nő. A kapott eredmények: 55 Korri- %-os összetétel Oszlop noidszám koenzimB2i koenzim kísérőkorr. •'_="' mg Megegyzés 1—4 , 1189 5—8* 111,2 effluens 90,3 65 * Számított érték. 96,70 64.60 3,30 (A) 35.40 (B) kb. 100 4
