158809. lajstromszámú szabadalom • Eljárás krisztályos B12 koenzim és B12 vitamin gyártására
158809 6 A gyantaréteg ezen első részéről kapott eluátumot kristályos Bi2 vitaminná vagy kristályos B12 koenzimmé dolgozzuk fel. B|2 vitamin előállítása esetén a tiszta Bj2 koenzim-tartalmú eluátumhoz cianid-ionokat adunk. Az oldatban maradt cianid-felesleg és a leszakadt adenin eltávolítására az eluátum hatóanyagtartalmát alumíniumoxidon megkötjük, leoldjuk és oldószer, előnyösen aceton hozzáadásával kristályosítjuk. A kristályosítás más ismert módszerrel is megoldható. B12 koenzim előállítása esetén is alkalmazhatunk alumíniumoxidos adszorpciót, különösen, ha igen magas hatóanyagtartalmú terméket kívánunk előállítani. A megkötést elvégezhetjük úgy, hogy az eluátum aceton-koncentrációját növeljük, majd alumíniumoxid oszlopon folyatjuk át az ily módon kapott oldatot. Eljárhatunk úgy is, hogy oldószermentesítés után az eluátumot extrakciónak vetjük alá és az extraktumot folyatjuk át alumíniumoxidon. Erre a célra alkalmazhatunk például fenolos extrakciót. A végterméket közvetlen kristá'yosítással is izolálhatjuk. Ebben az esetben növeljük az eluátum aeetontartalmát, vagy bepárlásos töményítés után állítjuk be a megfelelő acetonkoncentrációt. A gyantaágy további részét, amely a B12 koenzimet kísérő korrinoidok fő tömegét tartalmazza, elkülönítve eluáljuk. Az eluátumot oldószermentesítés után a következő gyártási tételhez részben vagy egészben visszavezetjük. Eljárhatunk úgy is, hogy az eluátumhoz cianid-ionokat adunk. Ekkor az eddig ismert eljárások valamelyikével választjuk el az előállított B12 vitamint a kísérő faktoroktól és ismert módon kristályosítjuk. Előnyösebb, ha a gyanta-rétegnek azt a részletét, amely a kísérő korrinoidok fő tömegét tartalmazza, a következő gyártási tétel adszorbeáltatásánál használjuk fel. Eljárásunk segítségével jó kitermeléssel állíthatunk élő tiszta, kristályos B12 koenzimet és tiszta kristályos B12 vitamint ipari méretekben, gazdaságosan és minimális veszteségek mellett. Eljárásunk részleteit a példákban szemléltetjük. Példák 1. Propionibacterium shermanii-t 4% glukózt, 2% kukoricalekvárt, 3% ammóniumszulfátot, nyomelemeket és bioszanyagokat tartalmazó táptalajon tenyésztünk anaerob viszonyok között; a fermentálást .30 C°-os hőmérsékleten hajtjuk végre. 8 óránként 20%-os nátriumkarbonát oldattal semlegesítünk, majd a sejttenyészet növekedésének utolsó szakaszában, mintegy 40 órás fermentálás után 5,6-dimetilbenzimidazol prekurzort adagolunk. A fermentáció idejét 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 a szénhidrát-tartalom csökkenése és a prekurzor beépülése szabja meg, ez kb. 48 óra. A baktériumsejteket a fermentléből szűréssel kinyerjük. E biomasszából víz hozzáadásával 15 m;! , 10 g/100 ml szárazanyagtartalmú szuszpenziót készítünk. A sejtszuszpenzió 69,5 gamma/ml korrionid-koenzimet tartalmaz, összesen 1043 got. Ennek összetétele 90,1% B12 koenzim és 9,9% kísérő korrinoid-koenzim faktor. A sejtszuszpenziót 100 C°-on 5 másodperces hőexpozícióval pH=5-ön, fény kizárása mellett feltárjuk. A feltárás végén 19 m3 térfogatot és 54,5 gamma/ml korrionid-koenzimet mérünk. — A feldolgozás további műveleteit is fény kizárása mellett végezzük. — A feltárt léből 25 l-t elveszünk, mely 1360 mg korrionidkoenzimet tartalmaz, ebből a B12 koenzim hatóanyag 1225 mg és ebből végezzük a további feldolgozást. Erőteljes kevertetés közben 1 n sósav lassú hozzáadagolásával a szuszpenzió kémhatását pH=4-re állítjuk, 15 percig kevertetjük, majd 0,1 n nátriumhidroxid oldatot adagolunk 1 pH/30 perc sebességgel, pH—6 értékig. A művelet eredményeként az oldat Kjeldahl módszerrel mért N tartalma 300—400 gamma/ml N koncentrációról 100—150 gamma/ml N tartalomra csökken. A sejtmasszát ezután kiszűrjük és a hatóanyagtartalmat kimossuk. Az oldatot, melynek térfogata 32,3 1, 1140 mg hatóanyagot tartalmaz, koncentrációja 39,5 gamma/ml korrinoid-koenzim, százalékos összetétele 89,4% B12 koenzim és 10,6% koenzim faktor, Wofatit EZ gyantán megkötjük. Oszlopot készítünk 0 2 cm üvegcsöveket használva 75 ml-es gyantatöltettel és ebből 8 egységet sorbakötünk. Az adszorbens gyantát 1%-os nátriumhidroxid oldattal, majd 1%-os sósavoldattal aktíváljuk. A megkötés végeztével 850 ml ionmentes vízzel a sorbakötött oszlopokat változatlan lineáris sebességgel átmossuk. A 8 oszlopot párhuzamosan eluáljuk neutrális kémhatású 50%-os vizes aeetonnal. Az egyes oszlopokról a következő eluátumokat nyerjük: KorriÖsszetétel%-os Osz1 op noid-Megszám koenzim B mg 12 koenzin kísérő korr. jegyzés 1 475 98,15 1,85 2 325 97,15 2,85 3 191,5 95,15 4,85 A 4 116 92,00 8,00 5 '58 84,00 16,00 6 24,4 60,00 40,00 B 7 16,4 46,50 53,30 8 11,6 20,00 80,00 elfolyó m oldat 52 kb. 100 3
