158809. lajstromszámú szabadalom • Eljárás krisztályos B12 koenzim és B12 vitamin gyártására
3 ják és a terméket több lépésben tovább tisztítják. A módszer hatásfoka kb. 30%. Az eljárások mindegyike igen körülményes. Felhívják ugyan a figyelmet az anyag bomlékonyságára, azonban a tisztítás során a B12 ko- 5 enzim stabilitási optimumától eltérő viszonyokat kénytelenek alkalmazni. A szabadalmi leírásokban a leírt példák kis méretű termeléseket adnak meg. A tisztítási lépések üzemi kivitelezése során hosszú átfutási idők jönnének létre 10 és magas anyagfelhasználási költségek mellett még rosszabb kitermelést eredményeznének. Az ismertetett szabadalmakétól eltérő elv szerint valósítják meg a DBCC előállítását az 15 1422 040 sz. francia szabadalmi leírás szerint. Az eljárás szerint cianokobalamin biokonverziőját végzik koenzimmé Propionibacterium freudenreichii alkalmazásával. Az eljárás hátránya, hogy először a cianokobalamint kell előállítani, 20 majd azt enzimatikusan koenzimmé átalakítani, végül a keletkezett koenzimet töményíteni és tisztítani, tehát több lépés együttes hatásfokával kell számolni. 25 Kristályos B12 vitamin előállítására igen sok eljárás ismeretes, (pl. 72 232 sz. holland szabadalmi leírás). Az eljárások szerint a B12 vitamin előállítását célzó eljárások során a kobalamint ciánkobalamin formában választják el a so kísérő korrinoidoktól és tisztítják. Találmányunk tárgya eljárás kristályos B12 koenzim és/vagy kristályos Bj2 vitamin előállítására korrinoidokat termelő baktériumok fer- 35 mentációja során kapott biomasszából fény kizárása mellett történő feldolgozással — feltárás, hatóanyagkoncentrálás, tisztítás és kristályosítás — azzal jellemezve, hogy a biomassza feltárása során oldatba került, főleg nitrogén tar- 40 talmú szennyezéseket fokozatos kicsapással a biomasszán kötjük meg oly módon, hogy az oldat pH értékét 4-re állítjuk, majd fokozatosan 5,5—6,5 értékre emeljük, majd a biomassza eltávolítása után a kapott oldatból pH 6—7 érté- 45 ken porózus színtelenítő abszorbens gyantaágyon a B12 koenzimet és az egyéb korrinoidok egy részét frontális adszorpciós kromatográfiával elválasztjuk, majd a gyantaoszlopról a terméket B|9 koenzim formában eluáljuk, mimellett a B|2 koenzim főtömegét tartalmazó gyantarétegeket és a kísérő konrinoidoik főtömegét tartalmazó gyantarétegeket elkülönítve dolgozzuk fel. Találmányunk egyik alapja az a felismerés, hogy a biomassza a koenzim feltárása során oldatba került szennyezések legnagyobb részét megfelelő körülmények között meg tudja kötniígy a technológia korai fázisában nagytisztaságú oldatot kapunk. Megállapítottuk, hogy az így nyert oldat adszorptív készsége aromásamin alapú színtelenítő Wofatit EZ típusú gyantán megközelíti a kristályos koenzim vizes oldatáét. Megállapítottuk továbbá, hogy a gyantán a Jeaerizimek frontális adszorpciós kromatográfiá- gs 4 val elválaszthatók. A kapott eluátum olyan tiszta, hogy közvetlenül kristályosítható a B12 koenzim, vagyis egylépésben valósítottuk meg a B12 koenzim tisztítását, koncentrálását és kromatografálását. Kívánt esetben az eluátum tetszés szerinti hányada cianid-ionok hozzáadásával B|2 vitaminná alakítható, tehát egyetlen berendezésben állítjuk elő a tetszés szerint változtatható célvegyület eluátumát. Az első lépés, a feltárás, önmagában ismert módon végezhető el. (Puskás Aurél: Mezőgazdasági és fermentációs iparok. Tankönyvkiadó, Budapest, 1966) Előnyös, 'ha a feltárást folyamatos üzemben, 100 C° körüli hőmérsékleten legfeljebb 1 perces hőexpozícióval végezzük el. A feltárást és a további műveleteket sötétben végezzük, a koenzim fotolízisének kiküszöbölésére. A leírt módon kivitelezett feltárás során a B12 koenzim oldatba megy és a hőokozta bomlás jelentéktelen. Kevés olyan szennyeződés kerül oldatba, amely a további tisztítási lépéseket kedvezőtlenül befolyásolná. A feltárt oldat tisztítását úgy végezzük, hogy az oldatba került zavaró szennyezéseket a nagy felülettel rendelkező baktérium-masszán kötjük meg. A nagy pH-ját ennek érdekében 4-re állítjuk sav, vagy savanyú só segítségével és valamely alkálihidroxid lassú adagolásával a pH-t 6-ra emeljük. Eközben főként a nitrogén-tartalmú szennyezések válnak ki és a biomasszán megkötődnek. Magasabb pH a deszorpció veszélye miatt kerülendő. Az alacsonyabb pH a koenzim bomlását idézi elő. A fermentált koenzimeket a biomassza nem adszorbeálja. A művelet után a biomasszát szűrjük. Az így előkészített vizes oldat Bj2 koenzim tartalmát adszorbens gyantán, előnyösen aromásamin alapú kondenzációs adszorbens gyantán adszorbeáltatjuk, célszerűen oly módon, hogy az álló gyantaágyon vezetjük át az oldatot. Az adszorbenst megkötés előtt 1%-os lúg oldattal, majd vizes mosás után 1%-os savoldattal aktíváljuk. Ezután vízzel neutrálisra mossuk. A DBCC a gyantán kvantitatív megkötődik és az 1—2% szárazanyagot tartalmazó elfolyó oldat elönthető. Az adszorpció során a megfelelően előkezelt oldatból töményítés és tisztulás mellett az oszlop hossza mentén kromatografálódás következik be. A B12 koenzim fő tömegét tartalmazó gyantarétegeket elkülönítve eluáljuk. Ez a gyantaréteg első része, amely a B12 koenzimet jelentéktelen mennyiségű koenzimfaktor mellett tartalmazza. Az eluálást szerves oldószer és víz, pl. aceton és víz neutrális kémhatású elegyével végezhetjük el. .2
