158648. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-aminopenicillánsav előállítására szilárd benzilpenicillin amidohidroláz alkalmazásával
3 158648 4 Ezenkívül a sejteknek, mint enzimhordozóknak alkalmazásakor az enzimatikus hidrolízis során tapasztalhatók voltak benzilpenicillin és a 6-aminopenieiMnsav /?-4aktám gyűrűgéníefc felbomlását eredményező mellékreakciók. [CHAPMAN, M. J, HOLT, R. J., MATTOCKS, A.'R., STEWART, G. T., J. gen. Microbiol., 36, 215 (1964); HOLT, R. J., STEWART, G. T, J. gen. Microbiol., 36, 203 (1964); ARCOS, J. M, RUIZ, M. C, MUGLCA, J. D., J. Bacteriol., 93, 1870 (1968)]. Ez a tény szintén kitermelésveszteséggel járt. A mellékreakciók mértéke a beadagolt enzimhordozó sejt mennyiségével arányosan nőtt. Mindezen, a 6^ammopeniieillánsiav kolhozatalt kedvezőtlenül befolyásoló hátrányok egy része kiküszöbölhető abban az esetben, ha az enzimatikus hidrolízist sejtmentes közegben végezzük. A sejtmentes hidrolízis előfeltétele azonban, hogy a benzilpenidMin aimidohidroláz enzim az E. coli NY 1/3 sejtékiből kiszabadítható legyen és vízoldékony állapotba kerülj ün. így, a fi-aminopenicillánsav sejteken történő adszorpciójával járó kitermelésicsökkenés kiküszöbölhető ugyan, a hidrolízis kivitelezéséhez alkalmazott benzilpenicillin mennyisége azonban továbbra is függ a benzilpenicillin amidohidroláz általunk icsaik kis mértékiben szabályozható aktuális aktivitásától. E hátrány csak akkor szűnik tmeg teljesen, ha az lenzimféhérjét szilárd formában izdiáljuk és a hidrolízis mértékét az isimért aktivitású enzirnfeharje és szuíbsztrátja adagolási arányának megválasztásával, a szerves kémiai reakciókhoz hasonlóan szabályozzuk. Vizsgálataink során arra a (meglepő felismerésre jutqttunlk, hogy a benzilpenieilin amidohidroláz az Escherichia codi NY 1/3 sejtekből kivonható, ha a sejteket vizes szuszpenzióban szerves oldószerek jelenlétéiben, anaerob körülmények között tartjuk. A vizsgálatok során az is kiitűrat, hogy a szerves dldószerek közül csak azok jöhetnek számításba, amelyek a különben kiáHciumfoszfát gélhez kötött sejtek fizikokémiai tulajdonságaiban (150 782 fez. magyar szabadalmi leírás) nem okoznak jelentős változást. így a metilizolbuitiliketon alkalmazása a kalciumfoszfát gélen kötött sejtek 'fizifcofcémiiai viszonyait olyan mérítékig változtatja meg (csapadékkiválás), hogy az enzim kivonása után a sejitek szűréssel vagy centrifugálássial történő izolálása lehetetlenné válik. Ugyanakkor a toluol vagy idimetilszülfoxid egyenlkénti, de különösen kombinált alkalmazásával az enzimíehérje még a (kálciumfoszíát gélen kötött sejtekből is extaahálható oly módon, hogy a sejtek az enzimkivonást követően egyszerű szűréssel eltávolíthatók voltak. Az enzimfehérje sejtekből történő kivonása és a sejtek .kiszűrése után az enzimfahérje alkalmas enzimkicsapószerrel (pl. ammóniumszuMiáttal) kicsapható, a képződött csapadék szűréssel izolálható, majd a szűrőnedves enzirnfehérje vízmentes acatonnál történő átmosással szárítható. Az így kapott szilárd, de vízoldékony enzimfehérje ós a benzilpienicilllin adagolási arányát 6 nem korlátozzák a sejt jelenlétéből következő, adszorpciós és mellékreakciát eredményező tényezők, ugyanakkor imind az enzim, minid a fcenzilpenicil'lin mennyiségét úgy szabályozhatjuk, hogy a hidrolízis a reakciórendszeriben jej0 lenlevő benzilpienicilllin ifenilacetamliäo költéseire nézve kvantitative végbsmenjen és lemellétt nagy 6^ammopenicillánsav koncentrációjú oldatot kapjunk. E művelet sorián a legmagasabb enzíiimfehérjeHkoncentráció sem haladja meg a 15 reakció elegy 0,30 %-áit, mely tény lehetővé teszi a 6-aminopemeillánsav bármilyen technológiával történő izolálását a reakcióelegyből. Az eljárás előnye, hogy az organikus oldószeres seijtfeltárássial a sejt teljes benziilpenicil-2Q lín arnidohidroláz . készlete hozzáférhetővé válik, ami a korábbi eljárással hasznosítható enzimmennyiségnek 2,5—4,0-j szarese. Eljárásunk további előnye, ihögy a szilárd benzillpenicillin aimtdohlidroláz enzimifehérje tárolható, mely (tény lehetővé teszi, hogy a benzilpienicillm fenilacetaimoJdo kötéseknek enzimatikus hidrolízisét függetlenné tegyük az E. coli sejtek fermentációs úton történő előállításának technológiai és kapacitásbeli nehézségeitől. A jelen bejelentésünk tárgyát képező eljárás alkalmazásával — • mely az első munkafolyamatra, vagyis az enzimatikus hidrolízisre van műszaki haladást jelentő hatassál —, az enzimatikus hidrolízis hatásfoka a il50 782 sz. mad5 gyár szabadalomban leírt 61%—7'8% helyett, közel 100%-fla (mely közöl kvantitatív GPK —6—APS átfordítás) emelkedik. Eljárásunkat, melynek lényege a benzilpeniiis cillin fieniliaicefca^mido kötésének enziimatikus hidrolízise szilárd, vízoldékony benzilpeniciíllin amidohidroláz alkalmazásával, az alábbi példákion szemilélteítjülk, -melyek nem tekinthetők korlátozó jellegűeknek. 1. példa: Az Escheridhia coli ML—ililil törzs thenyészle veiben levő sejteket kálciumfoszfátt gélre adszorbeáljuk az alábbiak szerint: 500 liter sejttartalmú fermentléhez 4000 g Na2 HP0 4 -il2 ILO-it, var "mint 2000 g CaCl2 -<t adagoltunk erőteljes kevertistés közben. A + 24 C°-on egy órán át tartó kevertetés után a pH-t H3PO4 5J adagolásával, elektromos pH mérőn történő ellenőrzés rmellefct pH 8,0 értékre állítottuk be. Ezt követően a kialakult igéire adszorbeálódott sejteket keretes szűrőprésen (megszűrtük. A kapott szűrőnedves sejtmassza súlya 15 kg volt. 60 Escherichia coli ML—111 kálciumfoszfát gélen kötött sejtjeinek szűrőnedves masszájából 15 kg-ot 15 liter ioncseréült vízben szuszipendáltunk, majd a szuszpenzióihoz 300 ml jtoluolt 65 adtunk. 2
