158648. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-aminopenicillánsav előállítására szilárd benzilpenicillin amidohidroláz alkalmazásával
5 158648 6 A szuszpenzíio alapos elikeverése után a tartóadényt hermetikusan lezártuk és az edényt 30 C°-on termosztátban tartattuk. Alkalmas nyilasion keresztül naponta vett minták elemzése azt mutatta, 'hogy a sejitmentesre szűrt oldat benzilpenicillin amidctódröláz aktivitása az eredeti aktivitás 2,5x~ére növekedett és a csúcsiaiktiviitiás a sejtmentes lében a 14. napon érite el a maximumot. Ekkor a szuszpenziót szűrőnuccson megszűrtük, és a ssjtmienbes tiszta oldathoz, melynek térfogata il4.'6 liter volt, 7300 g (NH/,)s SO/,-ot .adtunk lassú kevertetés mellett. E művelet során az oldalt hőmérsékletté 25 C° volit. A 2 óra alatt kicsapódott enzimfehérjéit szűrőnuceson ikiszűrtülk. Az elfolyó lében nem volt mérhető tbenzilpenieiliin amidohidroláz: aktivitás. A nuecsnedves enzimfehérjét a nuccson 1000 ml pro lanalysii acetonnal kezeltük. A fehérjét ezután vákuumexszikkátorban 2 őrén át, 20 Cc -on acatonmentesítettük. A kapott enzknimieonyisiég 435 g volt, gramimonként 1540 E benzilpenioillin amidohidroláz aktivitással. 1000 (ml 1/15 Na2 HP0 4 pufferbe, annak 42 C°-ra történő felmelegítése után 17,4 g benzilpenicillin K-sót adagoltunk. A ibenzilpenicillíin tartalmú oldatba ekkor annyi einzimfehéirjét adagoltunk, mely biztosította a jelenlevő öszszes fenilacetamido kötés kvantitatív hidrolízisét. Ez jelen esetiben 30 g volt 46 200 E összakitivitással. A íreafcciárendszer hidrolízis következtében csökkenő pH-ját N iNaOH-nak az oldat folytonos elektrometrikus pH ellenőrzése köziben történő, adagolásával kompenzáltuk, így az oldat pH-jáit folyamatos an pH 8,0 értéken tartottuk. Az oldat 6^aim:iino-peniiciiMnsav és b snzlilpeniciilin konoenltrációj ánaík jodoimetriás elemzése azt mutatta, hogy 4 óra alatt a reakciórendszerben jelenlevő összes benzilpenicillin í'emlacetaimido' kötése 6-aminopenicillánsavvá és fenilecetsavvá hidroliziálóidott. A csúcs 6--aminopenicilMnsiav titer ekkor 10 000 ,ug/ml volt és benzilpienicillin nem volt kimutatható a ireiakciórendszierlben. Ezt követően az oldat 6—APS tartalmát a 153 897 sz. magyar szabadalom szerinti eljárással izoláltuk. Kitermelés a bontott liére vonatkoztatva 63% volt. 2. példa: Escherichia coli ML—111 kálciumf osztat gélen kötött sejtjeinek szűrőnedves masszájából 15 kg-ot 15 liter csaipvízben szuszpendáltunk, majd a szuszpenzióhoz 300 ml dimetilszulfoxídwt adtunk. A szuszpenzió elikevemése után a tairltóed'ényt hermetikusan lezártuk és az edényt 30 C°-on termosztátban tartottuk. A naponta végzett 'elemzések azt 'mutatták, hogy a sejtmentesre szűrt oldat ibenzilpenicillin aimidoihidroláz aktivitása az eredeti aktivitás S-^zorosára növekedett és a csúcsaktivitás a sejtmentes lében a 12. napon érte el a maximumát. Az 1. példa szerinti módon előállított enziimfehérje mennyisége 450 g volt, gramimonként 2920 E benzilpenioillin amidahidroláz aktivitással. 16 g enzimfehérjét 1000 ml ionmentes vízben oldottunk. Az oldatba, annak 40 'C°-ira történő fel melegítése után 17,4 g benizilpenicillin K-sót adagoltunk. A reakciórendszier gyorsan csökkenő pH-ját 5 N NaOH-val kompenzáltuk, folytonos eláktromietriiikus pH ellenőrzés mellett. Az oldat pH-ját 8,1 értéken tartottuk. Az oldat 6^aminopenicillánsav és benzilpenicillin koncentrációjának jodometriás elemzése azt mutatta, hogy a csúcsititer 6—APSnre nézve a reakció beindítását követő 3. árában volt észlelhető. Az oldat tit ere '6—APS-re nézve ékkor 10 000 /jig/ml volt >és benzilpenicilliin nem volt a rendszeriben kimutatható. Ezt követően az oldat 6—APS tartalmát az 1. példában jelzett eljárás szerint izoláltuk. A kitenmelés a bontott lére vonatkoztatva 67% volt. 3. példa: E művelet sarán az 1. és 2. példákban vázolt módon jártunk 'dl, csupán a szerves oldószerek esetében 300 ml toluolit és 300 ml dimetuszulffoxidot együttesen alikalimaztunk. A hermetikusan elzárt tártalóedényt 25 C°-on tartottuk. A naponta vett minták elemzése során kitűnt, hogy a sejtmenites oldat benzilpenicilliin amidohidiroláz enziimaktivitásának maximuma a 10. napon volt észlelhető, és. az enzimaktivitás .az eredeti érték 4-szieresére emelkedett. A szűrés és lacetonos szárítás után kapott enzimmennyiség 430 g volt, grammonként 4620 E beinzilpenicillin amidohidroláz aktivitással. 1000 ml 1/15 M Na2 HP04 pufferbe annak 42 C°-rá történő felmelegítése után 20,7 g bemzilpenieillin piperidin sót adagoltunk. A hidrolízist 10 g, grammonként 4620 E aktivitású szilárd beinzilpenicillin amidohidroláz enzimnek a benzilpenMllinitiartalmú oldatba történő adagolásával indítottuk be. A reakiciónendszer pH-iját 1 N NaOH adagolásával pH 7,8 értékben tartottuk. A jodometriáisan miért csúestitier 16—APS-re nézve a reakció beindítását követő .3. órában volt észlelhető. Az oldat titere 6—APS-re nézve 'ekkor 10 000 /ig/ml volt, és benzilpenioillin piperidin, só jodoimetriiás mérésseF. nem volt la rendszerben található. Ezt követően az oldat 6—APS tartalmát az 1. példában jelzett eljárás szerint izoláltuk. A kitermelés a bontott lére vonatkoztatva 69,5% vofllt. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás '6-aminopenkillánsav előállítására azzal jellemezve, hogy la benizíílpenicillin fenilaoetamido kötésének hidrolízisét Escherichia coli ML—üli (deponálva az OKI-ben 1969-ben, 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
